肠内免疫营养对创伤后大鼠肠屏障功能的影响临床医学论文.doc

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肠内免疫营养对创伤后大鼠肠屏障功能的影响_临床医学论文作者：余利坚徐亮姚晖魏仁志綦晓龙【摘要】目的：研究肠内免疫营养对创伤后大鼠肠道屏障功能的影响。方法:将30只Wistar大鼠随机分为3组，即对照组、普通肠内营养组、肠内免疫营养组。行胃造瘘术后早期分别给予普通饲料、肠内营养剂、肠内免疫营养剂等，行肠内营养7 d，测量小肠黏膜形态和小肠黏膜IgA+、CD3+、CD4+和CD8+细胞数量。结果：小肠绒毛高度、肠腺隐窝深度、黏膜厚度以及绒毛表面积等相关的形态学参数测量值显示，肠内免疫组均优于对照组(P<0.05)，与普通营养组相比差异无统计学意义(P>0.05)。对照组和普通肠内营养组大鼠小肠黏膜IgA+、CD3+、CD4+和CD8+细胞数低于肠内免疫营养组(P<0.05)。结论：肠内免疫营养能较好的改善术后大鼠的小肠机械屏障功能，促进小肠黏膜屏障功能的恢复，增强其肠道免疫功能。【关键词】肠道营养·肠内免疫营养·大鼠，Wistar【ABSTRACT】Objective:To study effects of enteral immunonutrition on intestinal mucosa barrieral function in wound rats.Methods:30 Wistar rats were randomly divided into three groups,with ten rats in each group(ie.control group,enteral nutrition and enteral immunonutrition group).After the germ-free operation of gastrostomy,rats in each group of enteral nutrition were treated with thesocaloric and isonitrogenous nutritional formulas respectively for 7 days.The ileum membrane morphological parameters and the quantity of IgA+,CD3+,CD4+and CD8+cell(each HP)in the ileum membrane were detected.Results:The villous height,crypt depth,mucosal thickness and villous surface area of ileum were increased in EN and EIN compared with control group(P<0.05),but it is no significance between them(P>0.05).The quantity of IgA+,CD3+,CD4+and CD8+cell is increased in EIN compared with control and EN group.(P<0.05).Conclusion:enteral immunonutrition may improve intestine mechanical barrierl function,promote restoration of the rat small intestine mucous membrane barrier function,and improve intestine immune barrierl function.【KEY WORDS】Enteral nutrition·Immunounutrition·Rat,Wistar实验表明，当肠道饥饿12～18 h，肠道黏膜结构功能下降，因此手术或创伤后立即给予肠内营养，可以增加肠黏膜的血流量，防止细菌移位[1]。观察重度感染、创伤等严重应激患者的临床情况发现，这类患者机体中存在不同的代谢改变，对营养物质的需求与代谢亦不相同，单纯维持氮平衡和补足热量是不够的。如果肠内给予一些免疫增强物质，以特定方式刺激免疫细胞，不仅能够增强免疫应答功能，维持正常、适度的免疫反应，调整细胞因子的产生与释放，减轻有害或过度炎症反应，还能保护肠屏障功能完整，减少细菌移位。这种方式称免疫增强型肠内营养。研究早期给予肠内免疫营养对手术或创伤后机体的影响，特别是肠道屏障功能的影响，有十分重要的意义。1材料与方法1.1实验动物和分组选用健康清洁级8周龄左右Wistar大鼠30只，体质量190～270 g，雌雄各半，由泸州医学院动物科提供(动物质量合格证号为：川医动字第2401115,质量为一级)。按随机数字表法分为3组：对照组(Control)、普通肠内营养组(EN)和肠内免疫营养组(EIN)，每组各10只。1.2动物模型制作和处理大鼠适应性喂养2 d后，经无菌手术构建Wistar大鼠胃造瘘模型，术后置于22℃～26℃、湿度40%～70%的安静、通风良好的环境中单笼饲养。除对照组给予正规大鼠专用饲料外，EN组、EIN组分别给予不同成分的肠内营养剂(等氮等热量)，经胃造瘘管给予肠内营养液。EN组给予瑞素，EIN组给予瑞能。各组能量供应均为1 037 kJ/(kg·d)。于大鼠术后开始喂养，第1天注入全量的1/2,第2天注入全量的2/3,第3天开始注入全量，喂养7 d后处死大鼠，留取末段回肠标本进行检测。1.3肠内营养液和检测试剂瑞能(Supportan)和瑞素(Fresubin)均购于Fresenius Kabi-华瑞公司。两种营养剂成分见各自说明书。其中每100mL瑞能添加精氨酸0.625 g，使瑞能每100mL蛋白质由5.85 g增至6.475 g，热量由130 kcal增至132.75 kcal。小鼠抗大鼠CD3+、CD4+和CD8+抗体均购于Serotec公司，山羊抗大鼠IgAα重链特异性抗体购于Rockland公司，SP系列试剂盒和相关的二抗均购于北京中杉生物技术公司。1.4检测指标和方法1.4.1肠黏膜形态学观察留取的末段回肠标本进行HE染色后，每只动物取5张不连续的切片，每张切片顺次取奇数视野观测10个小肠绒毛，并测量绒毛高度、肠腺隐窝深度、黏膜厚度以及绒毛表面积。1.4.2肠黏膜免疫细胞数量检测严格按照试剂盒说明对留取标本进行免疫组织化学染色后，每张切片观察不相邻的5个视野,计算每张切片平均每个高倍(×400)视野IgA+、CD3+、CD4+和CD8+的阳性细胞数。1.5统计学处理采用SPSS11.0统计软件包进行分析，计量资料以x±s表示，组间均数比较采用方差分析，P≤0.05为差异有统计学意义。2结果30只大鼠中，EN组1只于术后6 h死亡，原因不详。EN组有1只、EIN组有2只大鼠因术后胃造瘘管脱出或堵塞而退出实验，其余26只大鼠完成实验。2.1小肠黏膜形态学观察各组大鼠小肠壁层次清楚，黏膜上皮结构完整，无明显充血和炎性细胞浸润(图1)。EN组和EIN组肠黏膜绒毛高而密集，其绒毛高度、腺隐窝深度、黏膜厚度和绒毛表面积均明显高于对照组(P<0.05),EN组和EIN组间比较差异无统计学意义(P>0.05，表1)。2.2小肠黏膜免疫细胞数量的比较IgA+、CD3+、CD4+、CD8+细胞质呈均匀的棕黄色，细胞核呈深蓝色，绝大部分阳性细胞局限于黏膜层内(图2～5)。EIN组大鼠肠黏膜内免疫细胞数量多于对照组和EN组(P<0.05，表2)，EN组大鼠肠黏膜内免疫细胞数量多于对照组(P<0.05，见表2)。3讨论胃肠道是人体最重要的免疫器官之一，其完整的屏障功能对于维护健康状态有极其重要的意义。肠道屏障主要包括：黏膜屏障、化学屏障、免疫屏障和生物屏障等4部分。任何一部分受损，均可导致肠道屏障功能损害，导致细菌移位，增加相关并发症。肠上皮70%的营养供应来自肠腔内的直接吸收，如果缺乏肠内营养的吸收，肠黏膜将处于病理状态[2]。研究证实，肠道饥饿18～20 h肠上皮就开始萎缩和脱落[3]。术后大鼠机体处于应激状态，小肠黏膜受损，肠道通透性的增加，免疫功能受到抑制，各种炎症因子大量产生。精氨酸、短链脂肪酸等是肠道黏膜能量的重要来源，机体内这类物质需求量远大于产生量，如无外源补充，肠黏膜的结构和功能都将受到损害。普通的大鼠饲料无法提供相应的底物来维持氮平衡和蛋白质合成，导致肠道黏膜更新障碍，屏障作用也有所降低。本研究发现，EN组和EIN组大鼠的小肠绒毛高度、肠腺隐窝深度、黏膜厚度、绒毛表面积均优于对照组(P<0.05),表明肠内营养可以减少应激对大鼠肠道黏膜的损害，促进肠道黏膜更新和修复。而EIN组与EN组之间差异无统计学意义(P>0.05)，表明所有肠内营养均能起到营养肠道上皮的作用。这一现象是否普遍存在，与肠内营养持续时间有无关联，尚不清楚。我们计划针对这些疑问，就肠内免疫营养对肠黏膜形态学的持续影响做进一步研究。淋巴细胞是免疫系统的主要成分，肠道拥有人体最大的黏膜相关淋巴样组织。肠道免疫屏障与肠黏膜中各种淋巴细胞构成的肠相关淋巴样组织(gut-associated lymphoid tissue，GALT)的免疫功能有关。其中T淋巴细胞亚群对于维护肠黏膜的免疫屏障发挥重要的作用[4]。肠道免疫系统中另一个起核心作用的物质是分泌型IgA，其相对分子质量为36 000，是肠道分泌物中含量最丰富的免疫球蛋白。肠黏膜IgA是肠道免疫的第一道防线，在预防细菌黏附和移位上发挥关键作用[5]。本研究发现，通过肠内营养，特别是肠内免疫营养，可以提高大鼠肠道黏膜IgA+、CD3+、CD4+、CD8+细胞的数量，促进应激大鼠肠道黏膜免疫屏障的恢复，提高了大鼠的免疫功能。本研究所用的肠内免疫营养制剂含有多种免疫营养成分，均能发挥提高肠道局部和机体的免疫功能的作用。体外实验证实，培养基中缺乏精氨酸时，细胞生长受抑制，外周血淋巴细胞转化率下降，细胞DNA、RNA和蛋白质合成减少，淋巴因子IL-2、可溶性IL-2受体、γ-IFN产生减少[6]。精氨酸作为多胺和一氧化氮(NO)的前体物质，能够促进细胞的增殖，使真皮细胞的细胞周期进入S期;精氨酸还是羟脯氨酸的前体物质，能够加速胶原合成和创面愈合。精氨酸能够促进自然杀伤细胞活性，激活外周血中的单核细胞，调节T淋巴细胞和巨噬细胞分泌细胞因子，对机体免疫系统起调控作用。精氨酸的代谢产物精胺、精咪是重要的淋巴细胞增殖的刺激物,能够促进淋巴细胞增殖,增强机体的免疫功能。ω-3多不饱和脂肪酸可以减少炎性介质PGE2的产生，降低IL-1、TNF等细胞因子的产生，调节机体细胞免疫功能、抑制炎症反应。RNA是细胞分裂增殖的重要底物，可能参与调节细胞免疫应答反应。核苷酸能诱导IL-1β、TNF-α、INF-γ的释放，增强循环T淋巴细胞的数目和功能，提高巨噬细胞活性，刺激NK细胞的细胞毒作用[7]。对创伤后大鼠的应用肠内免疫营养，能够保护肠道黏膜，改善肠道黏膜屏障功能;特定的免疫增强物质能够保护和改善肠道免疫屏障功能，最终提高免疫能力和手术耐受能力，促进肠道正常结构和功能的恢复。【参考文献】[1]任成山.SIR和MODS的研究现状与展望[J].中国急救医学,1999,11:498-501.[2]Pscheidl E,Schywalsky M,Tschaikowsky K,et al.Fish oil-supplemented parenteral diets normalize splanchnic blood flow and improve killing of translocated bacteria in a low-dose endotoxin rat model[J].Crit Care Med,2000,28(5):1489-1496.[3]Kantsos H,Papadopoulos S,Perrea D,et al.Effects of nimodipine administration on small bowel mucosa under conditions of laparotomy and consequent 48-hour starvation in a rat model[J].Ann Ital Chir,2008,79(2):143-149.[4]McGhee JR,Mestecky J,Elson Co，et al.Regulation of IgA synthesis and immune response by T cell and interleukins[J].J Clin Immunol,1989,9(3):175-179.[5]吴国豪.肠道屏障功能[J].肠外与肠内营养，2004,11(1):44-47.[6]Popovic PJ,Zeh HJ 3rd,Ochoa JB.Arginine and immunity[J].J Nutr,2007,137(6Suppl 2):1681S.[7]徐亮，姚晖，庞明辉，等.胃肠道恶性肿瘤围手术期肠内免疫营养的临床研究[J].中华现代外科学杂志，2005,2(15)：1355-1357.