细菌金属β内酰胺酶检测方法的评价临床医学论文.doc

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细菌金属β内酰胺酶检测方法的评价_临床医学论文作者：孟素慧，刘丽文，翁亚贤【摘要】目的比较用EDTA.Na2和2巯基乙醇为酶抑制剂的协同过筛法来检测细菌金属酶的敏感性，为临床筛选金属酶，探究细菌的耐药机制提供依据。方法以EDTA.Na2和2巯基乙醇为酶抑制剂，头孢他啶（CAZ）头孢噻肟（CTX）和亚胺培南（IPM）为底物在MH平板上用纸片扩散法进行抗生素协同敏感性检测。结果对28株对IPM或三代头孢耐药的已知产金属酶的菌株进行以上两种方法的检测，应用2巯基乙醇筛选法检出的金属酶阳性率78.6%(22/28)；应用EDTA筛选法检出金属酶阳性率57.1%(16/28)；两种方法共同使用检出阳性率92.9%(26/28)。结论两种方法无显著性差异(χ2=1.75＜χ20.05（1）=3.84，P>0.05)，且两种酶抑制剂共同应用对金属酶的检出率更高。【关键词】金属β内酰胺酶；协同过筛法；酶抑制剂Evaluation to the Methods of Detecting Bacterium Metallobetalactamase Abstract：Objective To compare the sensitivity of two methods,in which EDTA and 2mercaptoethanol were used as enzyme inhibitors for detecting metallobetalactamase,and to screen metallobetalactamase so as to study the drug resistant mechanism.Methods The enzyme inhibitors were EDTA and 2mercaptoethanol and the substrates were ceftazidime,cefotaxime and imipenem.The microbiological sensitivity synergic tests were processed by KB method in the MH agar.Results Among the 28 strains of metallobetalactamase producing bacteria,the positive srains accounted for 57.1%(16/28)by EDTA method,78.6%(22/28)by 2mercaptoethanol method,and 92.9%(26/28)synchronously by the two methods.Conclusion It is concluded that there is no significant difference between these two methods,and that these two enzyme inhibitors are used at the same time can increase the positive rate of metallo-beta-lactamase detection.Key words：metallobetalactamase;sensitivity synergic method;enzyme inhibito亚胺培南（imipenem，IPM）为碳青霉烯类抗生素，有极强的抗菌活性，8 mg/L的IPM可抑制98%以上的临床主要致病菌，特别适用于治疗严重的医院感染和免疫缺陷患者，但随着IPM的广泛使用，抗药株在逐年增加。细菌产生的β内酰胺酶大部分系活性部位带丝氨酸残基的酶类，也有一小部分是活性部位为金属离子的酶类，称为金属β内酰胺酶（metalloβlactamase），简称为金属酶。金属酶是一类对β内酰胺类抗生素有着广泛水解作用的酶类，对所有抗生素，包括青霉素类、头孢菌素类（一、二、三代）和碳青霉烯类等均产生耐药，给临床治疗带来很大困难。因此金属酶的研究越来越受到重视，对该酶的检测可以进一步探究细菌对多种抗生素耐药的机制。国内外已有较多关于金属酶检测方法的报道[5~7]，我们选用了两种简便易行、可在临床细菌室广泛使用的方法。基于金属酶的活性基团依赖于金属离子的特性[3]，选用两种金属离子的螯合剂EDTA.Na2和2巯基乙醇破坏其活性基团，并结合三种抗生素（CAZ，CTX，IPM）观察协同抑菌现象，对两法的结果进行分析，现将结果报告如下。1材料与方法11材料1.11试剂与材料直径6 mm厚1 mm的空白纸片（自制）、MH营养琼脂干粉（生物梅里埃公司）、分析纯EDTA.Na2（沈阳试剂厂）、2巯基乙醇、亚胺培南（IPM 10μg/片，英国oxoid公司）、头孢噻肟（CTX 30μg/片）、头孢他啶（CAZ 30μg/片，北京天坛制药厂）。112菌株来源辽宁省人民医院细菌室提供IPM耐药的产金属酶的菌株28株，其中铜绿假单胞菌10株（1~10号）、芳香黄杆菌1株（11号）、嗜麦芽窄食单胞菌17株（12~28号）。12方法121 EDTA.Na2纸片的制备精确称量0.840 6 g，分子量为336.24的EDTA.Na2溶解于25 ml双蒸水中，配制成0.1 mol/L的EDTA.Na2溶液，取5μl于空白纸片上制成EDTA.Na2含量为1.68 mg/片，无菌环境下室温放置30 min，使其自然干燥。122菌株传代将在冰柜内冻存的28株菌株取出，在血平板上进行传代（18~20 h）。123接种受试菌将传代所得的菌落配制成菌悬液（106CFU/ml），并将菌悬液用棉拭子均匀地涂抹在MH平板上。124贴药敏纸片分别在每个接种完受试菌的平板正中贴上IPM纸片，在其上下两端分别贴上EDTA.Na2纸片和空白纸片，与其中心间距为14 mm；在IPM纸片左右两侧分别贴上CTX和CAZ纸片，与其中心间距为11.3 mm，这样，CAZ和CTX纸片与EDTA.Na2纸片和空白纸片的中心间距为18 mm。125加2巯基乙醇由于2巯基乙醇是易挥发物质，所以最后将其加在上述空白纸片上，避免由于其挥发造成的加入量的偏差，每片加5μl。将完成试验的平板放入35℃温箱，孵育24 h。126结果的判定EDTA.Na2纸片或2巯基乙醇纸片与CAZ，CTX，IPM三纸片中任何一纸片出现抑菌环扩大现象则为阳性，如无此现象则表示阴性。第3期细菌金属β内酰胺酶检测方法的评价孟素慧，等2结果21产金属酶的28株菌中，EDTA筛选法检出阳性株数为16株，阳性率为57.1%；巯基化合物筛选法检出阳性株数为22株，阳性率78.6%；两法共同使用检出阳性26株，阳性率92.9%。详见表1。表1两种方法检出含金属酶细菌中阳性菌株数及阳性率（略）22 EDTA筛选法检测阳性而巯基化合物筛选法检测阴性的菌株为4株，巯基化合物筛选法检测阳性而EDTA筛选法检测阴性的菌株为10株。两法同时检测阳性株为12株，两法共同检测阴性株为2株。两法检验结果比较无显著性差别（χ2=1.79＜χ20.05（1）=3.84，P>005），并且由表1可知两法共同使用检出结果的阳性率更高。详见表2。表2两种方法检出的阳性及阴性结果比较（略）3讨论1982年Saino等于嗜麦芽窄食单胞菌中分离出一种β内酰胺酶，不仅能水解碳青霉烯类而且能水解其他广谱β内酰胺类抗生素。1989年Bush等将这种酶定为金属β内酰胺酶（metallobetalactamase），归于β内酰胺酶第Ⅲ类。目前已发现多种金属酶，如铜绿假单胞菌多产生IMP1型酶、嗜麦芽窄食单胞菌主要产L1型酶、嗜水气单胞菌产CphA酶、脆弱类杆菌产生CphA，NMR酶等[1]。虽然它们的分子组成存在差异，但在其活性中心均含有金属离子[2]，所以这些酶都可以被金属离子螯合剂结合而失去活性[3,4]。国内外已有较多关于金属酶检测方法的报道，但目前国际上仍没有推荐方法。我们选用28株已用PCR方法证实产金属酶的细菌，用较为简便经济的两种方法—EDTA协同过筛法[5]和巯基化合物筛选法[6]对其进行检测。协同法联合使用三种底物是由于不同的金属酶对不同的底物的水解能力存在有差异，同时选用多种底物可以减少其检测的不稳定性。对检测结果按配对计数资料的χ2检验方法进行分析，得出两法并无显著性差异（χ2=1.79＜χ20.05（1）=3.84，P>0.05），且两种酶抑制剂同时使用可提高金属酶的检出率。有10株EDTA筛选法检测阴性而巯基化合物筛选法检测阳性的菌株和4株EDTA法检测阳性而巯基化合物法检测阴性的菌株，我们考虑可能是由于不同的酶抑制剂对不同型金属酶的抑制能力不同所致。两法合用仍有2株菌的金属酶未被检出，考虑是与该菌携带有基因但其产酶量相对较少有关。基于上述讨论，虽然两种方法没有显著性差别，但两种酶抑制剂同时使用可以使对各种金属酶不同结构活性中心的抑制作用相互弥补，提高检出率。使用PCR方法成本昂贵，且一种引物只能检测到产一种类型金属酶的细菌，而金属酶的种类有多种[5]，所以这种方法比PCR方法具有更好的可操作性和简便性，且标准KB法对抗生素纸片的选择也有很大的灵活性。临床微生物实验室可采用此种方法，来提高金属酶的检出率，以更好地探究细菌的耐药机制，并促使开发商进一步开发出对抗细菌产生的金属酶的有效药物。(致谢：在辽宁省人民医院检验科学习期间,胡主任、张主任、崔主任以及刘丽文等各科室的带教老师给了我很多帮助，在此谨以深深感谢！）【参考文献】\[1\]Nagano R,Adachi Y,Imamura H,et al.Carbapenem derivatives as potential inhibitors of various batelactamases including class B metallobetalactamases\[J\].Antimicrob Agents Chemother,1999,43:2497-2503.\[2\]杨立军,张晶,娄永新.金属β内酰胺酶与铜绿假单胞菌亚胺培南耐药\[J\].中国医学检验杂志,1999,22:127-128.\[3\]Concha N O,Janson C A,Rowling P,et al.Crytstal structure of the IMP1 metallo betalactmases from pseudomonas aeruginosa and its complex with a mercaptocarboxylate inhibitor:binding determinants of a potent,broadspectrum inhibitor\[J\].Biochemistry,2000,39:4288-4298.\[4\]Payne D J.Metallobetalactmasesa new therapeutic challenge\[J\].J Med Microbiol,1993,39:93-99.\[5\]吕火祥,孙明洪,刘建栋,等.协同过筛法检测金属β内酰胺酶的研究\[J\].中华医学检验杂志,2002,25(4):232-235.\[6\]Arskawa Y,Shibata N,Shibayama K,et al.Convenient test for screening metallobetalactamase producing gramnegative bacteria by using thiol compounds\[J\].J Clin Microbiol,2000,38:40-43.\[7\]Senda K,Arakawa Y,Ichiyama S,et al.PCR detection of metallobetalactamase gene(blaIMP)in gramnegative rods resistant to broadspectrum betalactams\[J\].J Clin Microbiol,1996,34:2909-2913.