脂多糖对人工关节磨屑诱导的骨溶解的影响_医学论文作者：段钢朱自强陈宏亮戈兵【摘要】目的探讨脂多糖(LPS)促进人工关节松动的可能性。方法采集30例人体外周血,分离单核细胞(MOs)，分组培养。实验分4组（n=30）：A组(对照组)仅加入MOs;B组加入MOs+LPS（100μg/L），C组加入MOs+超高分子聚乙烯微粒(UHMWPE);D组加入MOs+UHMWPE+LPS（100μg/L）。培养48 h后,放免法测定上清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)的含量。结果D组TNF-α和IL-6水平分别明显高于A、B、C组(P＜0.05);B组与C组之间TNF-α、IL-6水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论LPS能有效地刺激MOs分泌TNF-α、IL-6，效果与UHMWPE相似,且具有促进UHMWPE刺激TNF-α、IL-6分泌的作用，增强了UHMWPE的溶骨效应。【关键词】脂多糖;人工关节；磨屑;假体失败;骨溶解Abstract:Objective To explore the possibility of lipopolysaccharide(LPS)contributing to aseptic loosening of orthopedic implants.Methods 30 samples of peripheral blood were obtained from healthy human donors.Monocytes(MOs)were isolated and assigned to 4 groups（n=30 each）for culture.Group A was treated with MOs alone;group B with MOs+LPS(100μg/L);group C with MOs+ultrahigh molecular weight polylethylene(UHMWPE)debris;group D with MOs+UHMWPE+LPS(100μg/L).The cells were co-cultured for 48 h and the supernatant was tested for TNF-αand IL-6 content with radioimmunoassay.Results The levels of TNF-αand IL-6 were much higher in group D than in the other 3 groups.There was no significant difference in TNF-αand IL-6 levels between group B and group C(P>0.05).Conclusion LPS effectively stimulates MOs to secrete TNF-αand IL-6.LPS is not only similar to UHMWPE in action,but also promotes UHMWPE to stimulate the secretion of TNF-αand IL-6,therefore enhancing the osteolytic effect of UHMWPE.Key words:lipopolysaccharide;artificial joint;wear debris;prosthesis failure;osteolysis人工关节的无菌性松动是影响关节置换术后远期疗效的主要因素［1］。在无菌性松动的假体周围可以看见骨质有明显的溶解现象，使其支撑结构破坏，致使假体松动［2］。近年来,越来越多的临床实践表明，脂多糖(LPS)可黏附多种人工假体材料并刺激细胞产生肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素6(IL-6)等溶骨性因子［3］，从而促进骨溶解。本实验通过人外周血单核细胞（MOs）、超高分子聚乙烯微粒(UHMWPE)和LPS的混合培养，探讨LPS对人工关节松动的促进作用，为揭示人工关节无菌性松动提供理论与实践依据。1资料和方法1.1主要试剂LPS（E.coli.055:B5,Sigma公司）,RPMI 1640细胞培养液(GBCO公司),聚蔗糖-泛影葡胺分层液(FICOLL,上海试剂厂，沪Q/H G22222043289),小牛血清(特级,杭州四季青公司),六孔培养板(GBCO公司),TNF-αELISA试剂盒(解放军总医院科技开发中心放免研究所,最小检测浓度＜0.3μg/L),IL-6 ELISA试剂盒(R&D公司)。1.2样本采集随机选择健康献血者30例,其中男18例,女12例,年龄40～70岁,平均52.6岁。每例受试者采集外周血10 ml,肝素抗凝。1.3实验方法和分组采集的外周血以Hank液稀释1倍,分层液梯度离心法分离出MOs。洗涤3次,加含10%小牛血清的RPMI 1640培养液制成细胞悬液,细胞计数,调整细胞浓度至4×108/L,锥虫蓝排除法检测细胞活力均大于95%。向培养板中滴加细胞悬液,每孔加3 ml。置37℃、5%CO2恒温恒湿培养箱培养4 h,使细胞贴壁,利用MOs的贴壁性洗去非贴壁细胞,留下MOs。每板第1孔加入含10%小牛血清的RPMI 1640培养液3 ml,于第2孔中加入100μg/L的LPS悬液3 ml,余2孔中加入浓度为1012/L的UHMWPE悬液3 ml,于第4孔加入LPS使其浓度为100μg/L。即第1孔为仅有MOs的空白对照组(A组),第2孔为MOs+LPS 100μg/L(B组),第3孔为MOs+UHMWPE(C组),第4孔为MOs+UHMWPE+LPS 100μg/L(D组)。混匀,相同条件培养48 h后将细胞及液体混合物离心后取上清液，离心后放免法测定上清液中的TNF-α、IL-6含量。1.4统计学处理数据以±s表示，组间比较采用方差分析(ANOVA)和两两比较的q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。2结果4种不同处理组上清液中TNF-α、IL-6的含量见表1,方差分析提示4组细胞上清液中TNF-α、IL-6含量差异有显著性(P＜0.05)。两两比较显示:B、C、D组TNF-α、IL-6含量均明显高于A组(P＜0.05),B、C组TNF-α、IL-6含量差异无统计学意义(P＞0.05)，说明LPS和UHMWPE均可增强MOs分泌TNF-α、IL-6，效果相似；D组TNF-α、IL-6含量均明显高于B、C组(P＜0.05)，说明LPS具有促进UHMWPE诱导MOs分泌TNF-α、IL-6的作用，增强了溶骨效应。表1不同处理组TNF-α、IL-6的含量(略)3讨论人工关节置换术是治疗严重关节疾患的有效方法之一。但是，随着人工关节置换数量的增加以及人工关节使用年限的延长，人工关节的无菌性松动成为影响其远期疗效的主要原因。超过66%的髋关节翻修和近50%的膝关节翻修由人工关节无菌性松动引起［4］。目前多数研究认为各种磨损碎屑活化假体周围界膜中的巨噬细胞、异物巨细胞等细胞释放IL-6、IL-1及TNF-α等骨吸收因子，溶骨性因子直接或间接地激活破骨细胞，从而引起假体周围骨吸收、骨溶解，后者又可加重磨损，产生更多的微粒，形成恶性循环，使假体周围支撑骨量丢失，最终导致人工关节的无菌性松动。在生物性因素方面,磨损颗粒是无菌性松动发生的关键性因素［2］。然而，随着对无菌性松动的生物学机制研究的逐渐深入,LPS在加速人工关节的无菌性松动方面的作用逐渐引起重视。LPS是革兰阴性细菌所共有的细胞膜成分，具有与磨损颗粒相似的生物学作用，可刺激细胞产生TNF-α、IL-1、IL-6［5］，这些因子正是导致了人工关节无菌性松动的主要原因,并且LPS易黏附于多种人工假体材料及其磨损颗粒，如钛、钛合金、聚乙烯等［3，6～8］。Tatro等［9］发现在UHMWPE导致的骨溶解的鼠模型中有内毒素的积聚现象，其主要成分是LPS。在许多没有临床感染表现的松动假体上，常可发现革兰阴性菌细胞膜成分［10］。因此磨损颗粒引起的炎性介质释放、骨溶解及骨吸收等可能与其黏附的LPS密切相关。本实验通过在体外将人外周血MOs、UHMWPE、LPS进行共同培养，应用ELISA检测TNF-α、IL-6含量,发现B、C组含量明显高于A组(P＜0.05)，说明UHMWPE、LPS均可刺激MOs分泌溶骨因子TNF-α、IL-6；B、C组之间TNF-α和IL-6含量差异无统计学意义(P＞0.05)，提示在一定的剂量范围内LPS刺激MOs分泌溶骨性因子TNF-α、IL-6的作用与UHMWPE类似；D组TNF-α和IL-6含量明显高于B、C组(P<0.05),证明LPS具有促进UHMWPE诱导MOs分泌TNF-α、IL-6的作用，二者具有协同作用，增强了溶骨效应。到目前为止,不管假体设计的多么完美,所有类型人工关节的承重面都产生磨损颗粒［11］。由于LPS易黏附于磨损颗粒的生物学特点，使存在于人体循环血中的LPS可以在人工假体周围积聚。Skoglund等［12］认为体内存在着内毒素的清除机制，LPS在体内的去除和积累一直处于动态平衡，当体内LPS积聚超过其清除速度时，即可导致LPS的局部堆积，与磨损颗粒共同刺激溶骨性因子的分泌，引起骨溶解。本实验结果亦提示LPS具有促进UHMWPE刺激TNF-α、IL-6分泌的作用，在人工关节无菌性松动方面起着重要作用，为人工关节无菌性松动的预防和治疗提供了新的思路。当然，本实验仅仅是体外的初步研究，还有待于进一步的动物实验和临床研究证实。【参考文献】［1］Ren 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