右美托咪定联合顺铂对Lewis肺癌小鼠免疫功能影响分析目前化疗依然是治疗肺癌的主要手段,然而其严重影响患者的免疫功能,引起免疫抑制并发症[1]。右美托咪定(dexmedetomidine,Dex)是一种新型高选择性α2肾上腺素能受体激动剂,具有抗氧化、抑炎作用并影响细胞免疫功能[2,3]。IL-6是重要的炎性因子,其信号通路异常与卵巢恶性肿瘤的预后相关[4]。IL-6与白细胞介素6受体(IL-6receptor,IL-6R)结合可激活细胞表面gp130亚基,进而激活JAK/STAT、PI3K/AKT、IL-6/STAT3信号通路[5]。本研究通过制备Lewis肺癌小鼠模型,探究Dex对患鼠免疫功能的影响并分析其对IL-6/STAT3信号通路的调控作用,以期为肺癌的综合治疗提供新思路。1、材料与方法1.1实验动物近交系C57BL/6J小鼠72只,雄性,SPF级,10周龄,体质量20～30g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。Lewis肺癌细胞株,由中国医科大学基础医学院免疫学教研室提供。本研究经山东潍坊市益都中心医院医学伦理委员会批准。1.2主要试剂与仪器Dex注射液(100μg/mL),购自四川科伦药业股份有限公司;顺铂注射液,购自江苏豪森药业集团有限公司;碘化丙啶(propidiumiodide,PI),购自苏州宇恒生物科技有限公司;TNF-α、IL-6ELISA检测试剂盒,购自上海邦奕生物科技有限公司;抗IL-6、STAT3、p-STAT3单克隆抗体,购自SantaCruz公司。iMark酶标仪,来自Bio-Rad公司;5810R高速冷冻离心机,来自Eppendorf公司;HERAcell240i37℃恒温CO2培养箱,来自ThermoFisherScientific公司;Tanob-4500凝胶成像系统,来自Invitrogen公司。1.3建模与分组小鼠随机分为6组,每组12只,分别为对照组(N组):正常饲养,不做任何处理;假手术组(S组):构建Lewis肺癌小鼠模型时只注射0.2mL生理盐水,不做其他处理;模型组(M组):参考文献[6]建立Lewis肺癌小鼠模型,具体为用含10%FCS的RPMI1640培养液培养Lewis肺癌细胞,取对数生长期细胞并调整密度为1×107个/mL。小鼠适应性饲喂1w后,随机选取48只于右腋皮下注射0.2mLLewis肺癌细胞悬液,观察肿瘤生长情况。约D8可触及肿块,说明造模成功,D10开始给药处理。另3组为Dex组(D组):分别于D10、D12、D14瘤旁注射Dex,剂量为1μg/kg;顺铂组(C组):分别于D10、D12、D14瘤旁注射顺铂(以6.15mg/kg剂量溶于0.2mL生理盐水);Dex联合顺铂组(DC组):顺铂治疗的同时注射Dex,D10～D141次/d,连续注射5d。于D15收集外周血样本后颈椎脱臼处死小鼠,无菌分离肿瘤、脾脏及胸腺组织。1.4小鼠瘤质量、瘤体积及肿瘤细胞凋亡率的检测无菌条件下分离瘤组织并称重。取适量瘤组织,切碎并置于120目不锈钢滤网上;下方放置平皿,用眼科镊揉搓组织块,并用RPMI1640培养液冲洗直至揉碎组织块;用300目铜网过滤平皿中混悬液,去除细胞团块,用PBS冲洗获得单细胞悬液;调整细胞密度至1×109个/mL,加入200μLPI(50mg/L),FACS检测细胞凋亡率。1.5小鼠脾脏、胸腺指数的计算无菌条件下称重小鼠脾脏、胸腺组织,按以下公式计算脾脏、胸腺指数:脾脏指数=脾脏重量(mg)/体质量(g)胸腺指数=胸腺重量(mg)/体质量(g)1.6小鼠淋巴细胞、白细胞(whitebloodcell,WBC)、骨髓细胞(bonemarrowcell,BMC)计数血细胞计数仪常规计数小鼠外周血淋巴细胞、WBC。分离小鼠股骨,PBS冲洗骨髓腔,离心收集细胞沉淀并加入0.2mLPBS混匀,光镜下计数单根股骨BMC。1.7MTT法检测淋巴细胞增殖活性取脾脏组织制备淋巴细胞悬液,以1×106个/孔接种于96孔板,加入ConA(5mg/mL)培养48h;每孔加入20μLMTT溶液,孵育4h后弃去培养液,酶标仪检测D(490nm)。1.8小鼠外周血TNF-α、IL-6表达水平及瘤组织IL-6、p-STAT3、STAT3蛋白的测定分离获得小鼠外周血血清,ELISA检测各组小鼠血清TNF-α、IL-6水平,具体操作参考试剂盒说明书。Westernblotting检测瘤组织IL-6、p-STAT3、STAT3、β-actin(内参)蛋白表达,采用ImageJ软件进行灰度值分析。1.9统计学处理采用SPSS20.0软件进行统计分析,正态分布定量资料以x¯x¯±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用SNK-q检验。结果以P<0.05为差异有统计学意义。2、结果2.1小鼠生存状态评估研究过程中N组、S组、DC组未见小鼠死亡,M组小鼠于成瘤后D7、D9各死亡1只,D组于成瘤后D9死亡1只,C组于D8死亡1只。治疗5d后,N组、S组、DC组各剩余12只,M组剩余10只,D组、C组各剩余11只。2.2小鼠瘤质量、瘤体积、肿瘤细胞凋亡率检测M组、D组间瘤质量、瘤体积及肿瘤细胞凋亡率差异无统计学意义,与D组比较,C组、DC组瘤质量、瘤体积均显著减少,肿瘤细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。(图1、图2)图1各组小鼠瘤质量、瘤体积、肿瘤细胞凋亡率比较2.3小鼠体质量、脾脏、胸腺指数、WBC和淋巴细胞计数与S组比较,M组脾脏、胸腺指数均显著升高(P<0.05);与M组比较,D组、C组、DC组脾脏、胸腺指数、WBC、淋巴细胞计数均显著减少(P<0.05);与D组比较,C组脾脏、胸腺指数、WBC、淋巴细胞计数、BMC均显著减少(P<0.05);与C组比较,DC组脾脏、胸腺指数、WBC、淋巴细胞计数、BMC均显著升高(P<0.05)。(图3)图2肿瘤细胞凋亡率检测图3各组小鼠免疫状态比较2.4小鼠脾脏淋巴细胞增殖活性及血清IL-6、TNF-α水平检测与S组比较,M组淋巴细胞增殖活性、血清IL-6水平显著升高,TNF-α水平显著降低(P<0.05);与M组比较,D组、C组、DC组淋巴细胞增殖活性、IL-6水平显著降低,TNF-α水平显著升高(P<0.05);与D组比较,C组、DC组小鼠淋巴细胞增殖活性显著降低(P<0.05),IL-6水平显著升高(P<0.05),TNF-α水平有显著差异(P<0.05);与C组比较,DC组小鼠淋巴细胞增殖活性、血清TNF-α水平显著升高,IL-6水平显著降低(P<0.05)。(图4、图5)2.5肿瘤组织中IL-6、p-STAT3/STAT3蛋白表达量检测与M组比较,D组、C组、DC组肿瘤组织中IL-6、p-STAT3/STAT3蛋白表达量依次显著降低(图6,P<0.05)。图4各组小鼠脾脏淋巴细胞增殖活性比较图5各组小鼠血清IL-6、TNF-α水平比较图6各组小鼠肿瘤组织中IL-6、p-STAT3/STAT3蛋白表达量比较3、讨论Dex是一种选择性α2肾上腺素能受体激动剂,具有镇静作用[7]。本研究显示,D组瘤质量、瘤体积、肿瘤细胞凋亡率与M组相比差异无统计学意义,C组、DC组瘤质量、瘤体积较M组显著降低,瘤细胞凋亡率显著升高,提示Dex本身对瘤细胞无显著影响。顺铂可通过破坏DNA功能抑制肿瘤细胞有丝分裂,具有广谱抗肿瘤效果,为临床治疗肺癌、宫颈癌、乳腺癌等多种实体瘤一线用药,但对机体有一定毒性,患者可出现免疫抑制反应[8]。本研究结果显示,与M组比较,D组、C组、DC组脾脏、胸腺指数、WBC、淋巴细胞计数均显著降低;与C组比较,DC组脾脏、胸腺指数、WBC、淋巴细胞计数、BMC显著升高。脾脏是T、B细胞清除血源性抗原的重要外周免疫器官,胸腺是T细胞发育、分化、成熟的主要场所,胸腺和脾脏的状态是否正常是机体正常发挥免疫功能的关键[9]。以上提示Dex对顺铂治疗小鼠的胸腺、脾脏具有明显保护作用,可促进机体免疫功能,可能通过促进T细胞分化、发育,增强淋巴细胞抗肿瘤免疫应答。TNF-α主要由巨噬细胞及活化的T细胞分泌,其可促进APC对肿瘤抗原的提呈,在机体抗肿瘤免疫应答中发挥重要作用[10]。本研究显示,与S组比较,M组IL-6水平显著升高,TNF-α水平显著降低;与M组比较,D、C组淋巴细胞增殖活性、IL-6水平显著降低,TNF-α水平显著升高;与C组比较,DC组小鼠淋巴细胞增殖活性、血清TNF-α水平显著升高,IL-6水平显著降低,提示Dex联合顺铂可减轻化疗抗肿瘤引起的免疫抑制反应。IL-6与可溶性IL-6R结合可激活多条炎症通路。两者结合后可激活细胞表面gp130亚基,进而激活IL-6/STAT3信号通路。研究报道,Dex可通过抑制JAK2/STAT3信号通路改善LPS诱导的小鼠急性肺损伤[11]。本研究中,与M组比较,D组、C组、DC组IL-6、p-STAT3/STAT3蛋白表达量依次下降,提示Dex可能通过抑制IL-6/STAT3信号通路激活抑制IL-6释放,进而减轻顺铂抗肿瘤过程引起的免疫功能抑制。综上所述,Dex联合顺铂对肺癌小鼠的胸腺、脾脏、骨髓具有明显保护作用,可促进Lewis肺癌小鼠脾脏、胸腺指数、淋巴细胞计数增加,减轻顺铂对Lewis肺癌小鼠的免疫抑制功能,可能与抑制IL-6/STAT3信号通路激活有关。但关于Dex对肺癌小鼠的具体免疫保护机制尚不明确,有待进一步研究。参考文献：[1]王兵,关江锋,颜琳琳,等.消水方联合顺铂对肺癌移植瘤胸腔积液小鼠模型Th17/Treg免疫平衡的影响[J].中国实验方剂学杂志,2018,24(21):131-137.[2]沈金美,李李,蒋丽丽,等.盐酸右美托咪定对H2O2诱导的库普弗细胞氧化应激和炎性反应的影响[J].中南大学学报:医学版,2016,41(5):477-481.[3]孔岚,卢锡华.右美托咪啶对胸腔镜肺癌根治术患者围手术期炎症反应及细胞免疫功能的影响[J].中华医学杂志,2018,98(36):2929-2932.[4]陈玉花,刘宇,张福梅.卵巢子宫内膜异位症恶变与卵巢恶性肿瘤的关系及预后影响因素研究[J].临床和实验医学杂志,2015,14(14):1152-1154.[5]路海滨,高洋,禹珊珊,等.山豆根多糖对Lewis肺癌小鼠抑瘤作用及免疫功能影响的实验研究[J].中药材,2018,41(6):1459-1462.[8]章展,孙益青,唐小万,等.贝伐单抗联合顺铂对Lewis肺癌荷瘤小鼠免疫功能及血管内皮生长因子的影响[J].中国临床药理学杂志,2017,33(23):2394-2397.[11]徐颖臻,王耀岐,宁巧庆,等.右美托咪定通过抑制JAK2/STAT3通路改善脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤[J].临床麻醉学杂志,2015,31(11):1105-1108.刘丰华,邱凤玉,伊正君.右美托咪定联合顺铂对Lewis肺癌小鼠免疫功能的影响[J].现代免疫学,2020,40(05):386-390.基金:2017年山东省自然科学基金(ZR201709200273).
