妊娠滋养细胞疾病组织中端粒酶逆转录酶表达的研究医学论文.doc

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妊娠滋养细胞疾病组织中端粒酶逆转录酶表达的研究_医学论文作者：周健，毕淑宁，任玲，薛华，林萍，李桂林【关键词】妊娠滋养细胞疾病摘要:目的探讨人端粒酶逆转录酶（hTERT）在妊娠滋养细胞疾病中的表达及其临床意义。方法采用兔抗人端粒酶逆转录酶抗体，利用免疫组织化学方法检测29例妊娠滋养细胞肿瘤、18例葡萄胎和20例正常早孕绒毛组织中hTERT的表达，结合Leica Qwin图像分析系统对hTERT阳性细胞进行灰度分析。结果hTERT表达定位于细胞质。hTERT阳性细胞平均灰度值在妊娠滋养细胞肿瘤、葡萄胎和正常早孕绒毛组织中分别为123.31±11.93、99.00±11.21和102.55±16.35。hTERT在妊娠滋养细胞肿瘤中的表达明显高于葡萄胎和早孕绒毛组织，差异有显著性（P<0.01）。结论端粒酶的活化在妊娠滋养细胞肿瘤形成中可能起重要作用，端粒酶活性的检测可能是预测葡萄胎预后的重要指标。关键词:妊娠滋养细胞疾病;人端粒酶逆转录酶;免疫组织化学Abstract:Objective To investigate the expression of human telomerase reverse transcriptase（hTERT）in gestational tro-phoblastic diseases and its clinical significance.Methods In29gestational tropholbastic tumors（GTT），18hydatidiform moles and20normal early embryonic villi，the expression of hTERT was studied by using immunocytochemical staining and image analysis technique.Results The hTERTwas localized in cytoplasm，and its average grey level was99.00±11.21，102.55±16.35and102.55±16.35in GTT，hydatidiform moles and early embryonic villi respectively.The expression of hTERT was significantly higher in GTTthan in hydatidiform moles and early embryonic villi（P<0.01），and showed no difference between those in hydatidiform moles and early embryonic villi（P>0.05）.Conclusion Telomerase activation may play an important role in the genesis of trophoblastic tumors.Detection of telomerase activity is of potential value in making the prognosis of hyda-tidiform moles.Key words:gestational trophoblastic diseases;human telomerase reverse transcriptase;immunohistochemistry端粒是位于染色体末端的一段DNA的重复序列。其长度决定细胞的寿命。随着细胞分裂端粒不断缩短，当端粒缩短到一定程度时，细胞会发生衰老和死亡。端粒酶可维持端粒的长度使细胞处于一种永生化状态。而永生化是细胞恶变的必经步骤，因此端粒酶的激活可能与恶性肿瘤的形成和发展密切相关。妊娠滋养细胞疾病主要包括葡萄胎、侵蚀性葡萄胎和绒毛膜癌。其中葡萄胎可恶变为侵蚀性葡萄胎和绒毛膜癌。本研究通过对妊娠滋养细胞疾病和正常早孕绒毛组织中人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）表达水平进行检测，以探讨其在妊娠滋养细胞疾病组织中的表达情况及其临床意义。1资料和方法1.1标本来源标本为我院病理科存档的47例妊娠滋养细胞疾病石蜡标本。其中绒毛膜癌和侵蚀性葡萄胎标本29例（滋养细胞肿瘤组），完全性葡萄胎标本18例（葡萄胎组）。另取20例孕60天以内人工流产的早孕绒毛组织（早孕绒毛组）作为对照。所有标本均经甲醛固定、石蜡包埋，制成4μm切片待用。1.2免疫组织化学染色方法采用SABC法进行免疫组织化学染色。兔抗人端粒酶逆转录酶抗体和SABC试剂盒均由武汉博士德生物工程公司提供。免疫组织化学主要步骤为:石蜡切片常规脱蜡至水。3%H 2 O 2封闭5min，应用热修复抗原方法暴露抗原。正常山羊血清室温封闭20min;第一抗体（兔抗人抗体）稀释度1∶100，于4℃过夜;羊抗兔IgG，37℃20min。SABC复合物37℃20min。DAB显色。苏木素轻度复染。树胶封片。1.3图像分析和数据处理每张切片在高倍镜（10×40）下随机选取5个视野，利用Leica Qwin图像分析系统观察hTERT阳性细胞，测量细胞平均灰度值，实验数据以ˉx±s表示。1.4统计学分析用SPSS11.0软件进行方差齐性检验和方差分析。2结果hTERT表达定位于细胞质。随着免疫组织化学染色程度不同，hTERT阳性细胞胞质内可呈现浅黄色、棕黄色至棕褐色染色。hTERT在妊娠滋养细胞肿瘤、葡萄胎和正常早孕组织绒毛中均有表达。在妊娠滋养细胞肿瘤（绒毛膜癌和侵蚀性葡萄胎）中的表达显著高于葡萄胎组织和正常早孕绒毛组织，肿瘤组分别与葡萄胎组和绒毛组比较，差异均有显著性。葡萄胎组和绒毛组结果比较差异无显著性（表1）。hTERT在妊娠滋养细胞肿瘤中的表达见图1，hTERT在葡萄胎中的表达见图2。表1滋养细胞疾病和妊娠绒毛中hTERT检测结果（略）图1 hTERT在绒毛膜癌中的表达（SABC染色，×400）（略）图2 hTERT在葡萄胎中的表达（SABC染色，×400）（略）3讨论端粒酶的结构主要包括端粒酶RNA（human te-lomerase RNA，hTR）、hTERT和端粒酶结合蛋白。人体正常组织细胞中广泛表达hTR，但无端粒酶活性。hTERT具有逆转录酶的主要特性，在大多数端粒酶阳性的组织、肿瘤组织和永生化细胞系中，hTERT的表达与端粒酶活性的表达一致［1］。陈学军等［2］用hTERT基因反义寡核苷酸作用于子宫内膜癌HEC-1A细胞，发现能够下调hTERT蛋白的表达，抑制端粒酶的活性，抑制细胞的生长。证明hTERT为端粒酶激活的限速酶。目前，端粒酶活性检测技术报道较多的为TRAP法及其改良的方法，由于需用新鲜组织，标本采集困难，测定过程中易有RNA酶的污染，操作烦琐，这些均限制了其临床应用。我们采用兔抗人端粒酶逆转录酶抗体进行免疫组织化学检测，可以直接测定具有端粒酶活性的催化亚单位，石蜡标本来源方便，操作方法简单，还可以对hTERT在细胞内的表达进行定位观察。采用图像分析系统对hTERT阳性细胞进行灰度扫描分析，结果比目测观察更为客观和灵敏。本研究结果显示:hTERT在正常早孕绒毛和妊娠滋养细胞疾病中均有表达。绒毛膜癌和侵蚀性葡萄胎中hTERT的表达显著高于葡萄胎组织和正常早孕绒毛，统计学分析有显著性差异。而hTERT在葡萄胎和早孕绒毛中的表达无明显差异。妊娠滋养细胞疾病是一类组织来源和生物学行为有其特殊性的疾病。滋养细胞本身具有与肿瘤细胞相似的生物学特性，在妊娠早期滋养细胞增殖旺盛，具有侵蚀性。妊娠中、晚期，滋养细胞分化为终末细胞，其侵蚀性受到抑制。Rama等［3］利用滋养细胞分化的体外模型进行研究，结果表明，在胎盘分化过程中，端粒酶的活性受到负调节。葡萄胎为良性病变，一旦形成滋养细胞肿瘤则表现出恶性肿瘤的生物学行为，具有永生性和高度侵蚀性。有研究［4］表明，正常妊娠早期滋养细胞的端粒酶活性呈阳性表达，妊娠中晚期为阴性。Kyo等［5］报道正常早孕绒毛76%为端粒酶阳性，而晚孕绒毛只有4%为端粒酶阳性。Cheung等［6］的研究表明，在早期胎盘组织和良性葡萄胎中端粒酶活性的表达率并无显著差异。我们的研究发现，早孕绒毛和葡萄胎组织中端粒酶活性较低，葡萄胎恶变形成滋养细胞肿瘤后，则表现出较高的端粒酶活性。端粒酶在早期妊娠绒毛中呈阳性，中晚期妊娠转为阴性，在葡萄胎组织中的表达与早期妊娠绒毛相似，在滋养细胞肿瘤中高度阳性。由这一变化过程可以看出，端粒酶的活性与滋养细胞的幼稚性、增殖活跃和侵蚀性是相一致的，其活化在滋养细胞肿瘤形成中可能起重要作用。完全性葡萄胎虽属良性病变，但部分病例可转变为侵蚀性葡萄胎和绒毛膜癌，因此对葡萄胎预后的预测尤为重要。目前，临床上预测葡萄胎预后的高危因素包括高水平的hCG、子宫大于相应妊娠月份、出现卵巢黄素化囊肿、高龄等。但是其中任何一种因素都不能单独确切判断葡萄胎的预后。hCG检测虽具有高度的特异性和敏感性，但一般要等到葡萄胎排出后2个月，血hCG仍未达到正常值时才考虑有侵蚀性葡萄胎或绒癌的发生，此时可能已出现肿瘤远处转移。Amezcua等［6］的研究发现，持续性滋养细胞疾病中hTERT的表达明显高于非持续性滋养细胞疾病。Bae［7］也发现，在葡萄胎发生恶变的病例中端粒酶活性有更多表达。我们的研究结果也提示葡萄胎的发展与端粒酶的激活可能存在着一定的相关性。因此，端粒酶活性可以与子宫大小、刮宫前β-hCG水平联合起来预测葡萄胎恶变的发生，对于判断葡萄胎的滋养细胞是否有形成恶性肿瘤细胞的倾向可能有一定的临床价值。hTERT可能成为早期诊断或监测恶性滋养细胞肿瘤的一个重要标志物。参考文献:［1］Nishi H，Ohyashiki K，Fujito A，et al.Expression of telomerass subunits and localization of telomerase activation in hydatidiform mole［J］.Pla-centa，1999，20（4）:317-323.［2］陈学军，郑伟，王升启.人端粒酶催化亚单位反义核酸对子宫内膜癌细胞的抑制作用［J］.中华肿瘤杂志，2003，259（3）:212-215.［3］Rama S，Suresh Y，Rao AJ.Regulation of telomerase during human pla-cental differentiation:a role for TGF-β1［J］.Mold Cell Endocrinol，2001，182（2）:233-248.［4］王媛，赖仁胜，章瑞宣.米非司酮对妊娠滋养细胞端粒酶活性的影响［J］.中华妇产科杂志，2002，37（12）:739-740.［5］Kyo S，Takakura M，Tanaka M，et al.Expression of telomerase activity in human chorion［J］.Biochem Biophys Res Commun，1997，241（2）:498-503.［6］Amezcua CA，Bahador A，Naidu YM，et al.Expression of human te-lomerase reverse transcriptase，the catalytic subunit of telomerase，is as-sociated with the development of persistent disease in complete hydatidi-form moles［J］.Am J Obstet Gynecol，2001，184（7）:1441-1446.［7］Bae SN，Kim SJ.Telomerase activity in complete hydatidiform mole［J］.Am J Obstet Gynecol，1999，180（2Pt1）:328-333.