激活LXR对海马神经元神经甾体合成的促进作用医学论文.doc

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激活LXR对海马神经元神经甾体合成的促进作用_医学论文作者：张淑坤，杨荣慧，张翠欣，姜玲玲，侯艳宁【摘要】目的：研究肝X受体（LXR）激活对海马神经元神经甾体合成的影响.方法：将大鼠海马神经元体外培养至第7日，在培养液中加入2.0μmol/L TO901317，继续培养48 h.应用高效液相质谱联用（HPLCMS）分离测定培养液中游离型神经甾体孕烯醇酮（PREG）、脱氢表雄酮（DHEA）和结合型神经甾体孕烯醇酮硫酸酯（PREGS）、脱氢表雄酮硫酸酯（DHEAS）的含量；RTPCR方法观察海马神经元P450侧链裂解酶（P450scc）、甾体合成快速调节蛋白（StAR）和3β羟基甾醇脱氢酶（3βHSD）等神经甾体合成关键酶基因的mRNA的表达.结果：TO901317激活LXR，促进P450scc，StAR和3βHSD的mRNA表达，增加海马神经元培养液中神经甾体PREG，DHEA，PREGS和DHEAS含量.结论：LXR激活时，可通过上调海马神经元P450scc，StAR和3βHSD的mRNA表达，促进神经甾体的合成.【关键词】肝X受体；P450侧链裂解酶；神经甾体；海马,神经元【Abstract】AIM:To investigate the effect of liver X receptor(LXR)activation on the synthesis of neurosteriod in hippocampal neurons.METHODS:On day 7 of culture,hippocampal neurons were treated with 2.0μmol/L TO901317 dissolved in dimethylsulfoxide for 48 h.The mRNA expressions of P450 side chain cleavage(P450scc),steroidogenic acute regulatory protein(StAR)and 3βhydroxysteroid dehydrogenase(3βHSD)were measured by RTPCR and the contents of unconjugated neurosteriods pregnenolone(PREG),dehydroepiandrosterone(DHEA)and conjugated neurosteroids pregnenolone sulfate(PREGS),dehydroepiandrosterone sulfate(DHEAS)in medium were analyzed and determined using highperformance liquid chromatographymass spectrometry(HPLCMS).RESULTS:Incubation of hippocampal neurons with TO901317 significantly increased the expressions of P450scc,StAR and 3βHSD mRNA and the levels of PREG,DHEA,PREGS and DHEAS.CONCLUSION:Activation of LXR contributes to the synthesis of neurosteriod by upregulating the expressions of P450scc,StAR and 3βHSD in hippocampal neurons.【Keywords】liver X receptor;P450 side chain cleavageenzyme;neurosteroid;hippocampus;neurons 0引言中枢神经系统的胆固醇在甾体合成快速调节蛋白（StAR）的引导下被转运到线粒体内膜，然后由P450侧链裂解酶（P450scc）催化生成孕烯醇酮（PREG），后者在3β羟基甾醇脱氢酶（3βHSD）等的催化下转化成脱氢表雄酮（DHEA），PREG和DHEA在磺基转移酶的催化下生成结合型神经甾体孕烯醇酮硫酸酯（PREGS）和脱氢表雄酮硫酸酯（DHEAS），发挥生物效应.体外培养海马神经元和小鼠阿尔茨海默病（AD）模型均表明，用人工合成配体TO901317激活肝X受体（LXR）能增加其下游基因ATP结合盒转运体A1（ABCA1）的表达，阻止AD发生［1-2］.本实验旨在观察LXR激活时对海马神经元神经甾体的合成和分泌有何影响.1材料和方法1.1材料DMEM、优级胎牛血清（Hyclone公司）；L左旋多聚赖氨酸、阿糖胞苷、二甲基亚砜、TO901317（Sigma公司）；胰蛋白酶（Gibco公司）；Trizol（美国Invtrogen公司）；逆转录试剂盒（美国Promega公司）；pfu DNA聚合酶（北京Tiangen公司）；Agilent液相色谱质谱联用仪［HP1100自动进样器、大气压化学离子源(APCI)及四极杆质谱检测器］；神经甾体标准品（Sigma公司）.1.2方法1.2.1海马神经元原代培养及处理采用文献［3］的方法，并稍加以改动.取当日新生Wastar大鼠，750 mL/L乙醇消毒，取出完整脑组织置于DMEM中，钝性分离海马并去除血管和脑膜，将海马剪成1 mm×1 mm×1 mm小块，1.25 g/L胰蛋白酶，37℃消化25 min.等体积种植液即含100 mL/L胎牛血清和1×105 U/L青、链霉素的DMEM终止消化5 min并洗涤1次.用Pasteur吸管轻柔吹打25次左右获得单细胞悬液，调整细胞密度为5×108/L，接种于预先L多聚赖氨酸处理过的35 mm培养皿中.置37℃，50 mL/L CO2及饱和湿度的细胞培养箱培养.培养至第3日改用含300μg/L阿糖胞苷的饲养液（含50 mL/L优级胎牛血清和1×105 U/L青、链酶素的DMEM），作用24 h后去除.培养至第7日，将所有神经元随机分为2组，每组6孔：处理组换含2.0μmol/L TO901317（溶于DMSO）的饲养液，对照组换含等体积DMSO的神经元饲养液，继续培养48 h.1.2.2海马神经元总RNA提取、RTPCR细胞用预冷的PBS轻漂2遍，Trizol法提取总RNA.RT及PCR参照试剂盒说明，PCR引物由上海生工生物工程技术有限公司.各待测基因退火温度、扩增产物长度见表1.取内参照βactin和待测基因PCR产物5μL，20g/L琼脂糖凝胶电泳.凝胶成像分析系统分析待测基因与βactin PCR产物的光密度比值.表1各基因的PCR引物序列、退火温度和产物长度基因（略）1.2.3细胞培养液中神经甾体的提取和纯化采用本实验室固定方法［4］.统计学处理：数据均用x±s表示.应用SPSS 13.0软件进行成组设计的t检验，P＜0.05有统计学意义.2结果2.1LXR激活对海马神经元ABCA1 mRNA表达的影响与对照组相比，处理组海马神经元ABCA1 mRNA表达升高，两组差异有统计学意义［（0.251±0.059）和（0.603±0.046），t=-10.034，P＜0.01）］.2.2LXR激活对海马神经元神经甾体合成关键酶P450scc、StAR和3βHSD mRNA表达的影响与对照组相比，处理组P450scc，StAR和3βHSD的mRNA表达均升高，差异有统计学意义（P＜0.05，图1，表2）.表2LXR激活对大鼠海马神经元P450scc，StAR和3βHSD mRNA表达的影响（略）2.3LXR激活对海马神经元培养液神经甾体含量的影响与对照组相比，处理组PREG，DHEA和PREGS，DHEAS的含量均增加，差异均有统计学意义（P＜0.05，表3).表3LXR激活对大鼠海马神经元神经甾体分泌的影响（略）3讨论AD是一种神经退行性病变，特征性病理改变为β淀粉样肽（βamyloid peptide，Aβ）在细胞外沉积形成老年斑，海马是Aβ最早出现和病变最严重的主要脑区.Aβ具有神经毒性，所致的胆碱能系统损伤是AD认知功能障碍的重要决定因素.神经甾体具有广泛的生物学作用，参与神经元的发育分化、突触的可塑性、神经递质的释放、学习与记忆等.WeillEngerer等［5］的研究发现，AD患者各脑区的神经甾体水平均较正常人降低，且皮质结合型神经甾体PREGS和DHEAS含量与Aβ含量呈负相关，提示神经甾体水平降低在AD的发生中起重要作用.在本实验中，我们检测到LXR激活后ABCA1 mRNA表达的上调，证实在体外培养的海马神经元TO901317能与LXR结合，并进一步激活其下游基因.我们还发现，LXR激活后，海马神经元神经甾体合成的关键酶P450scc，StAR和3βHSD的mRNA表达增加，游离型和结合型神经甾体的合成增多，说明LXR激活，上调海马神经元神经甾体合成关键酶P450scc，StAR和3βHSD的mRNA表达，促进海马神经元神经甾体的合成和分泌.大鼠海马神经元有P450scc，StAR和3βHSD等神经甾体合成酶的表达，能以区域特异性的方式合成各种神经甾体.其中结合型神经甾体PREGS和DHEAS是兴奋性神经甾体，能增强神经元的兴奋性和突触可塑性，促进动物的记忆获得和保持.PREGS是一种有效的记忆增进剂，能促进乙酰胆碱递质的释放，增强空间记忆，在老年大鼠海马中PREGS浓度的下降与学习记忆功能的丧失呈正相关［6］，而DHEAS是雄激素和雌激素的前体，可增强老年大鼠的学习和记忆，延缓脑衰老［7］.我们的研究首次表明，LXR激活时，除了上调ABCA1 mRNA表达，促进细胞内胆固醇外流，降低海马神经元Aβ产生外，还通过上调P450scc，StAR和3βHSD mRNA的表达来增加神经甾体的合成和分泌，从而增强学习能力，减缓记忆衰退，改善AD早期的认知功能障碍.【参考文献】［1］Koldamova RP,Lefterov IM,Staufenbiel M,et al.The liver X receptor ligand T0901317 decreases amyloid beta production in vitro and in a mouse model of Alzheimers disease［J］.J Biol Chem,2005,280:4079-4088.［2］Riddell DR,Zhou H,Comery TA,et al.The LXR agonist TO901317 selectively lowers hippocampal Abeta42 and improves memory in the Tg2576 mouse model of Alzheimers disease［J］.Mol Cell Neurosci,2007,34(4):621-628.［3］司徒镇强,吴军正.细胞培养［M］.西安:世界图书出版公司,2007:119-121.［4］张翠欣,侯艳宁.乙醇、乙醛对原代培养星形胶质细胞神经甾体合成的影响［J］.中国药学杂志,2006,41(5):395-398.［5］WeillEngerer S,David JP,Sazdovitch V,et al.Neurosteroid quantification in human brain regions:comparison between Alzheimers and nondemented patients［J］.J Clin Endocrinol Metab,2002,87(11):5138-5143.［6］Hige T,Fujiyoshi Y,Takahashi T.Neurosteroid pregnenolone sulfate enhances glutamatergic synaptic transmission by facilitating presynaptic calcium currents at the calyx of Held of immature rats［J］.Eur J Neurosci,2006,24(7):1955-1966.［7］Chen L,Miyamoto Y,Furuya K,et al.Chronic DHEAS administration facilitates hippocampal longterm potentiation via an amplification of Srcdependent NMDA receptor signaling［J］.Neuropharmacology,2006,51(3):659-670.