淀粉样前体蛋白酶与β淀粉样蛋白在衰老痴呆大鼠脑组织中的表达临床医学论文.doc

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淀粉样前体蛋白酶与β淀粉样蛋白在衰老痴呆大鼠脑组织中的表达_临床医学论文作者：蔡志友晏宁晏勇张骏王凤英王咏龙吴芳张建刚【摘要】目的观察衰老痴呆大鼠脑组织淀粉样前体蛋白酶(APP)、β淀粉样蛋白(Aβ)表达，探讨APP及Aβ在痴呆衰老中的作用机制。方法Wistar大鼠随机分为正常组、假手术组、4、6、8 w模型组。穿梭箱实验、Morris水迷宫实验检测认知行为学改变，蛋白质免疫印迹法和酶联免疫吸附法检测APP，酶联免疫吸附法检测Aβ在衰老痴呆大鼠脑组织中的表达，用图象分析仪测定光密度值。结果4、6及8 w模型组APP、Aβ表达较正常组及假手术组明显增高(P＜0.01)，3个模型组间比较无显著差异(P＞0.05)，APP和Aβ表达时间上无相关性，APP蛋白表达水平与学习、记忆正相关，Aβ蛋白表达水平与学习、记忆负相关。结论APP及Aβ在衰老痴呆大鼠脑组织表达增高，推测APP具有脑保护作用，Aβ参与了衰老痴呆的发病机制但不具有病理意义。【关键词】衰老痴呆；淀粉样前体蛋白酶；β淀粉样蛋白【Abstract】Objective To investigate expression ofβamyloid precursor protein(APP)andβamyloid protein(Aβ)in brain of rat with aged dementia and study the mechanism of APP and Aβin aged dementia.Methods Wistar rats were randomly divided into normal group，shamoperation group，4，6 and 8 weeks ageddementia model groups.Behavioural and cognitive changes of rats were tested by Morris water maze and shuttle box task.Expression of AβPP was measured by ELISA and Western blotting，and the level of Aβin brain tissue was detected by ELISA.The light density value was measured by imaging analysis.Results The expressions of APP and Aβin model groups were higher than those of normal and shamoperation groups(P＜0.01)，and there were no significant differenc among three model groups in the expressions of APP and Aβ(P＞0.05).The expression of APP and Aβhad no correlation in time.The level of APP had oppositive correlation with learning and remembering and the level of Aβhad negtive correlation with learning and remembering.Conclusions There are high expressions of APP and Aβin aged dementia rats.，which suggest APP play a neuroprotection role in aging process and Aβparticipate in the pathogenesis of aged dementia，but no pathological significance.【Key words】Aged dementia；βamyloid precursor protein；βamyloid protein阿尔茨海默病(AD)的病理特征是以β淀粉样蛋白(Aβ)沉积为核心形成的老年斑，脑内Aβ是由淀粉样前体蛋白(APP)经一系列分泌酶降解而来，所以对于APP、Aβ在AD中的发病机制研究尤为深入，而AD为年龄衰老相关性疾病〔1～3〕，那么作为Aβ沉积为核心的AD病理改变在老化机制有何联系，APP与衰老老化有什么联系国内外未见报道。因此，我们这里选择自由基中毒老化鼠作为我们研究对象，检测痴呆衰老大鼠脑内海马组织APP、Aβ的表达，初步探讨APP、Aβ的表达和痴呆衰老的联系。1材料与方法1.1动物Wistar成年大鼠30只，雌性，体重200～250 mg，第三军医大学野战医院动物研究所提供，动物中心许可证号：渝实动设施准第260号。1.2方法1.2.1试剂与仪器APP、Aβ40/42：Biosource International，Inc.，USA；D半乳糖(Dgal)：上海试剂二厂；大鼠跳台和大鼠穿梭箱程序自动控制仪均由重庆市神经病学重点实验室和重庆医科大学药学院提供。1.2.2模型制备与分组颈后皮下注射Dgal 120 mg·kg-1·d-1，连续6 w〔4，5〕，行为学检测具有明显认知功能障碍为建模成功，分别选取造模4、6、8 w作为观察点。随机分为正常组(等量生理盐水灌胃)、假手术组(等量生理盐水颈部皮下注射)、4、6、8 w模型组，每组6只。1.2.3行为学检测方法穿梭箱实验：记录动物在单独蜂鸣期间主动逃避时间和遭受电刺激时间以及电击次数。Morris水迷宫实验：①定位航行实验，测量大鼠获取经验(学习)的能力，记录大鼠找到平台时间，即潜伏期。②空间探索实验，用于测量大鼠保存经验(记忆)的能力，记录大鼠找到平台时间(学习潜伏期)，及120 s内穿越各象限平台相应位置的次数(记忆潜伏期)。1.2.4生化检测指标ELISA法检测血清Aβ40/42及海马、皮质APP水平，Western印迹法检测额顶叶皮质及海马APP蛋白含量。Western印迹条带经Geloc凝胶成像分析系统扫描处理，计算单位吸光度值和条带面积，将各实验点的总吸光度值与对照组比较，得到相对百分数。1.3统计学分析所有数据以x±s表示，采用SPSS11.0软件，进行方差分析、t检验和相关关系分析。2结果2.1大鼠学习记忆能力测试与假手术组和正常组大鼠比较，各模型组大鼠电击次数、学习和记忆潜伏期时间显著延长，主动逃避次数显著降低(均P＜0.01)；假手术组与正常组大鼠的检测结果无显著差异(P＞0.05)；各模型组间大鼠行为学检测结果无显著差异(P＞0.05)(表1)。表1各组大鼠学习记忆能力测试2.2各组Aβ40/42水平各模型组Aβ140和Aβ142水平均较正常组和假手术组明显增高(均P＜0.01)；正常组与假手术组间无显著差异(P＞0.05)；各模型组间也无显著差异(均P＞0.05)(表2)。表2各组Aβ140和Aβ142水平2.3各组APP水平Western印迹和ELISA法结果均显示各模型组鼠脑组织内APP水平较正常组和假手术组显著增高(均P＜0.01)；假手术组与正常组大鼠结果无显著差异(P＞0.05)；各模型组间也无显著差异(P＞0.05)(表3、图1)。表3各组APP水平2.4水迷宫实验记忆潜伏期与APP、Aβ40/42相关性分析直线相关分析结果显示Western印迹法和ELISA法检测APP的OD值及水墙与穿越D象限平台次数均呈负相关(r=-0.614 7和-0.702 1，均P＜0.05)；ELISA法检测的Aβ40、Aβ42水平与穿越D象限平台次数呈正相关(r=0.100 1和0.009 2，均P＞0.05)，APP量的变化和认知功能损伤呈反比关系，且具有统计学意义；Aβ的变化和认知功能损伤呈正比关系，但无统计学意义。3讨论自由基对机体健康的危害作用渐趋严重，引发机体多种生理功能障碍，促进多种老年疾病(如动脉粥样硬化、心脑血管疾病、脑神经细胞变性、糖尿病以及肿瘤等)的发生、发展，导致机体的衰老，直至死亡〔6〕。所以，我们皮下注射Dgal制作自由基中毒衰老痴呆大鼠模型，检测APP、Aβ在衰老痴呆大鼠脑组织中的表达。APP可在人体大多数细胞中表达，以神经元和星形胶质细胞中含量较丰富，主要经非淀粉样蛋白生成途径水解，促进神经细胞生长分化、增加神经突触的可塑性〔7〕、参与信号转导、促进细胞黏附、神经保护作用，脑挫伤后APP参与损伤神经元的修复。本研究发现APP在衰老痴呆大鼠脑组织中的表达均较正常组增高，老化大鼠APP表达在相对固定水平，而且APP量的变化和认知功能损伤呈反比关系，故推测APP在衰老痴呆大鼠脑内增高对衰老具有保护作用。正常生理条件下，APP经非Aβ生成途径代谢，只有在病理情况下，APP才通过Aβ生成途径造成Aβ的积聚。Aβ具有强大的神经元毒性，研究发现可溶性Aβ寡聚体是神经毒性Aβ的主要形式，早期即可破坏突触结构，影响突触功能，引起早期记忆认知功能障碍〔8～10〕。我们研究发现Aβ在衰老痴呆大鼠脑组织中的表达均较正常组增高，老化大鼠Aβ表达均在相对固定水平，而且Aβ的变化和认知功能损伤呈正比关系，但无统计学意义，所以，我们推测虽然Aβ产物增多参与了衰老记忆认知功能的障碍过程，但对于衰老认知损伤不具有病理生理意义。鉴于APP、Aβ在衰老痴呆大鼠脑组织中的高表达，和其量的变化与认知功能损伤有相关性，所以，我们推测AD是年龄衰老相关性疾病。因二者在衰老痴呆中的因果关系也不清晰，故此方面研究有待深入。【参考文献】1 Finch CE.A perspective on sporadic inclusionbody myositis：the role of aging and inflammatory processes〔J〕.Neurology，2006；66(2):S16.2 Valla J，Schneider L，Reiman EM.Ageand transgenerelated changes in regional cerebral metabolism in PSAPP mice〔J〕.Brain Res，2006；1116(1):194200.3 Wirths O，Weis J，Kayed R,et al.Agedependent axonal degeneration in an Alzheimer mouse model〔J〕.Neurobiol Aging，2007；28(11):168999.4李晓林,孙国光,马岩.黄蘑多糖不同组分对D半乳糖致衰老模型小鼠SOD、MDA的影响〔J〕.中国老年学杂志，2006;26(1):868.5徐淑云,卞如濂,陈修.药理实验方法学〔M〕.第3版.北京：人民卫生出版社，2001：1465.6 Reddy PH.Amyloid precursor proteinmediated free radicals and oxidative damage：implications for the development and progression of Alzheimer′s disease〔J〕.J Neurochem，2006；96(1):113.7 Masliah E，Crews L，Hansen L.Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer′s disease〔J〕.J Alzheimers Dis，2006；9(2):919.8 GunnMoore DA，McVee J，Bradshaw JM,et al.Ageing changes in cat brains demonstrated by betaamyloid and AT8immunoreactive phosphorylated tau deposits〔J〕.J Feline Med Surg，2006；8(4):23442.9 El Tannir El Tayara N，Delatour B，Le Cudennec C,et al.Agerelated evolution of amyloid burden，iron load，and MR relaxation times in a transgenic mouse model of Alzheimer′s disease〔J〕.Neurobiol Dis，2006；22(1):199208.10 Marksteiner J，Humpel C.Betaamyloid expression，release and extracellular deposition in aged rat brain slices〔J〕.Mol Psychiatry，2008；13(10):93952.