动物肝组织中丙二醛含量测定方法的改进药学论文.doc

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动物肝组织中丙二醛含量测定方法的改进_药学论文【摘要】目的初步探讨糖类物质对肝组织中丙二醛（MDA）含量测定的干扰并改进测定方法。方法该实验以含糖量不同的小鼠肝匀浆作为实验材料，通过葡萄糖在450nm和532nm处吸光度值的正相关关系建立直线回归方程，校正MDA在532nm处的吸光度值。计算出样品中MDA含量。结果肝组织中糖类物质会干扰MDA含量的测定，尤其是当样品中糖量含量间差异较大时，糖的干扰可能导致对机体受损程度的错误评判。结论改进后的方法更为科学、准确，可应用于动物肝组织丙二醛含量的测定。【关键词】丙二醛；灵芝多糖；葡萄糖；直线回归法丙二醛（Malomdialdehvde，MDA）是机体内的氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，形成的脂质过氧化物，测试MDA的量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度［1］。传统的测定方法是利用过氧化降解产物中的丙二醛与硫代巴比妥酸（TBA）在高温和酸性条件下缩合，形成的红色产物三甲川（3，5，5-三甲基恶唑2，4-二酮）于532nm处有最大吸收峰来进行测定的。这种方式常常受到多种物质不同程度的干扰［2］。其中最主要的干扰因素是组织内的可溶性糖。动物肝组织中含有大量的肝糖原，在测定时降解的葡萄糖会干扰测定。而探讨动物组织中糖类物质对MDA测定的干扰及消除方法还未见报道。本研究以含糖量不同的小鼠肝匀浆作为实验材料，初步探讨了葡萄糖对肝组织中MDA含量的测定的干扰并改进了测定方法。1材料1.1动物清洁级昆明种雄性小鼠，18～20 g，由湖北省疾病预防控制中心实验动物研究中心提供。动物饲养室温度为22～25℃，湿度为65%～80%。1.2试剂丙二醛（MDA）测定试剂盒，购于南京建成工程研究所。其它化学试剂均为分析醇。1.3仪器752型紫外光栅分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；飞鸽牌TGL-16C离心机（上海安亭科学仪器厂）；解剖剪。2方法2.1动物分组及给药清洁级昆明雄性小鼠48只，体质量18～20 g。参照文献［3］的方法，将实验动物按体重随机等数分为4组，即对照组（control group，CG）、多糖高剂量组（high-dose group，HG）、多糖中剂量组(medial-dose group，MG)、多糖低剂量组（low-dose group，LG），每组12只。对照组0.3 ml/d生理盐水灌胃，其余3组以0.3 ml/d不同浓度的灵芝多糖溶液灌胃，多糖高、中、低剂量的服用量分别为200，100，50 mg/(kg·d)。实验期间小鼠自由摄食及饮水，每5天称量1次体重，根据体重调整灌胃量，连续灌胃30 d。2.2灵芝多糖的制备实验室固体发酵所得灵芝菌丝体100 g加入7 L蒸馏水，85℃水提50 min。过滤所得的上清用旋转蒸发仪浓缩到0.1 L后，加入0.1 L无水乙醇4℃过夜沉淀，4 000 r/min离心20 min后取沉淀用适量蒸馏水溶解，冷冻干燥得到的褐色粉末为灵芝粗多糖。2.3肝匀浆的制备动物禁食过夜，次日颈椎脱臼处死、开胸、剖开腹腔。用4℃生理盐水清洗肝脏，用滤纸吸干肝表面水分，称肝重，加20倍干重的0.05 mol/L PBS缓冲液在匀浆机内匀浆，即制成5%肝匀浆。所有操作均在冰浴中进行。2.4小鼠肝组织糖类物质含量的测定小鼠肝组织糖类物质含量利用苯酚硫酸法［4］进行测定。2.5葡萄糖对TBA反应的影响测定2.5.1葡萄糖与TBA反应的比色测定因为肝组织存在较多的糖原，其在一定条件下可降解为葡萄糖，所以本实验以葡萄糖为标准探讨排除糖类物质对MDA-TBA反应干扰的情况。参照MDA测定试剂盒的测定方法，取200μl 50 mg/ml葡萄糖溶液，加入0.6%TBA（50%冰醋酸溶解配制）3.2 ml，沸水浴80 min后4 000 r/min离心10 min，取上清液经752型紫外光栅分光光度计400～700 nm扫描并记录结果。2.5.2 MDA测定条件对样品中肝糖原降解情况的影响取0.5 ml 5%肝匀浆上清液，加入1.5 ml 50%冰醋酸后沸水浴20～80 min，并设置对照组：取0.5 ml 5%肝匀浆上清液，加入1.5 ml蒸馏水。将各组反应液pH调至7.0后，加入2 ml DNS溶液煮沸5min后［5］测定各样品在540 nm处吸收值的变化。2.5.3 MDA-TBA反应中糖类物质干扰的排除(直线回归法)取不同浓度（0～50 mg/ml）的葡萄糖溶液，按照丙二醛（MDA）测定试剂盒上的说明，加入0.6%TBA（50%冰醋酸溶解配制）3.2 ml，置沸水于中80 min后4 000 r/min离心5min后，测定上清液在450 nm和532 nm下的吸光度值，分析其中的相关关系［5］。2.6两种方法测定小鼠肝组织MDA含量的比较方法1：步骤同试剂盒说明书所述一致，各组小鼠肝匀浆样品显色后测定450nm、532nm波长下的吸光度值OD450、OD532，根据直线回归方程求出各样品中糖分在532nm处的吸光度值Y532。D532与Y532之差即是MDA-TBA反应产物在532 nm下的吸光度值，用该值进一步计算得到样品中MDA含量。方法2：以试剂盒上提供的传统方法测定MDA含量。3结果与分析3.1小鼠肝组织中糖类物质的含量经过多糖灌胃的小鼠，其肝组织中糖类物质的含量均比对照组小鼠高。CG组、HG组、MG组、LG组小鼠肝组织中糖类物质的含量分别为(36.45±6.70),(47.05±9.57),(40.15±2.34),(38.64±9.41)mg/g。小鼠肝组织糖含量在对照组与试验组之间存在着较大差异。3.2葡萄糖对TBA反应的影响测定3.2.1葡萄糖与TBA反应的比色测定葡萄糖与TBA反应产物的吸收光谱如图一所示，反应产物在400～600 nm处均有吸收值，其中在450 nm处有峰值吸收。而赵世杰等［6］的研究表明，MDA与TBA显色反应产物在450 nm处无吸收。因此可以在450 nm测定吸光度值计算葡萄糖的含量，从而消除葡萄糖对MDA-TBA显色反应的干扰。3.2.2 MDA-TBA反应中糖类物质干扰的排除(直线回归法)图2显示了葡萄糖与TBA反应产物在在450 nm，532 nm处吸光度值间的相关关系。不同浓度的葡萄糖与TBA反应产物在450 nm处的吸光度值与532 nm处的吸光度值成正相关，相关系数达到0.999 8。其直线回归方程为：Y532=0.328 4+0.001 7OD450。样品显色后测定450 nm、532 nm波长下的吸光度值，根据方程求出该样品中糖分在532 nm处的吸光度值Y532，测定MDA含量时，通过校正，即减去Y532，可进一步计算样品中MDA的准确含量。3.2.3 MDA测定条件对样品中肝糖原降解情况的影响反应体系中的葡萄糖来自于肝组织中的糖原在一定条件下的降解。因此，肝糖原的降解程度与葡萄糖对MDA含量测定的干扰程度紧密相关。图3反映了MDA测定条件对样品中肝糖原降解情况的影响，对照组样品未经过高温和酸解，其还原糖的含量明显低于处理过的样品的还原糖含量。这说明高温和酸性条件下，肝组织中的糖原会降解为具有还原性的葡萄糖。水浴时间的延长，并没有改变样品中还原糖含量，这说明糖原物质的分解进程较快。因此反应时间对于MDA含量的测定没有较大影响。3.3两种方法测定的小鼠肝组织MDA含量的比较分别采用两种方法测定的小鼠肝组织MDA含量，结果如表1所示。糖类的存在对肝组织MDA含量的测定有一定的影响，未排除糖类物质干扰的传统测定方法将结果提高了4%～8%，造成测定误差，甚至改变了实验结果的趋势。表1两种方式测定肝组织MDA含量的比较（略）4讨论MDA能使DNA、膜蛋白、酶发生交联反应,使膜通透性增加,导致细胞膜结构、功能和代谢发生改变,对机体造成损害甚至死亡［7，8］。对MDA的准确测定可指导人们对机体的受损程度或耐受程度进行正确的评价，有助于医学、生物学、药理及工农业生产的发展。目前MDA测定方法有高效液相色谱法［9］、荧光法［10］、比色法,前两种方法由于仪器昂贵而难以普及,所以操作快速简便的比色法成为测定MDA含量的主要方法。但是这种方式检测方法常受到多种因素的干扰，尤其是当受试样处于特殊的情况下，机体内可能会积累很多的干扰物质，若采用常规方法则会使测量值偏离正常值。通过试验发现，葡萄糖与TBA反应产物在532 nm也有吸收，糖的存在干扰了样品中MDA含量的准确测定。通过直线回归法可排除糖类的影响。比较两种方法测定MDA的结果发现，由于糖类的存在，传统测定结果大于实际值，高出了4%～8%。尤其是当样品中糖类物质的含量间存在的差异越大，糖的干扰程度越大，可能导致对机体受损程度的正确评判。肝组织的糖原在酸性及高温条件下快速降解为葡萄糖，而后含量维持不变，这说明糖对MDA含量测定的干扰程度并不随时间的变化而变化，测定值稳定可靠。所以，改进后的方法更为科学、准确，可应用于动物肝组织丙二醛含量的测定。【参考文献】1］陈钧辉.生物化学实验［M］.北京:科学出版社,2003:43.［2］孙群.肉制品脂类氧化:硫代巴比妥酸试验测定醛类物质［J］.食品科学.2002,23(8):331.［3］卫生部卫生监督司.保健食品检验与评价技术规范［S］.北京:中华人民共和国卫生部,2003:87.［4］张惟杰.复合多糖生化研究技术［M］.上海：上海科学技术出版社,2003：308.［5］张松山,刘海,马长伟.三种TBA方法用于测定腌腊肉制品脂肪氧化程度适用性的研究［J］.肉类研究，2007,8:38.［6］赵世杰，许长成，邹琦，等.植物组织中丙二醛测定方法的改进［J］.植物生理学通讯，1994，30(3):207.［7］Joseph T.Oxidative stress,glutamate,and neurodegenerative diseases［J］.Science,1993:262.［8］Kinght J A,Smith S E,Kinger V E,et al.Reference infer valus for plasmalipoperorides:age-,sex-,and specimen-related Variations［J］.Clin Chen,1987,33:2289.［9］王会,郭立,谢文磊.抗氧化剂抗氧化活性的测定方法［J］.食品与发酵工业，2006,32(3):92.［10］中华人民共和国卫生部和中国国家标准化管理委员会.GB/T 5009.181-2003中国标准书号［S］.北京：中国标准出版社,2003：1100.