大鼠肾移植急性排斥模型中移植肾水通道蛋白2 mRNA表达的变化临床医学论文.doc

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大鼠肾移植急性排斥模型中移植肾水通道蛋白2 mRNA表达的变化_临床医学论文作者：臧崇森张纪周傅耀文张文岚王金国王伟刚【摘要】目的研究水通道蛋白2（AQP2）mRNA在大鼠肾移植急性排斥模型中移植肾表达的变化及意义。方法正常大鼠肾脏为正常对照组；Wistar大鼠作为供、受者建立同系基因对照组；SD大鼠为供者、Wistar大鼠为受者建立同种异体移植急性排斥组；SD大鼠为供者、Wistar大鼠为受者，术后给予免疫抑制剂环孢素（CsA）建立同种异体移植免疫抑制组；均为雄性大鼠。RTPCR半定量检测移植肾AQP2 mRNA在各组中表达的变化。结果同种异体移植急性排斥组移植肾AQP2 mRNA表达下调，与正常对照组比较有统计学差异（P＜0.05），与同系基因对照组和同种异体移植免疫抑制组比较有统计学差异（P＜0.05）。同系基因对照组和同种异体移植免疫抑制组中移植肾AQP2 mRNA表达的变化与正常对照组比较无统计学差异（P＞0.05）。结论AQP2 mRNA的表达在急性排斥时表达下调，可以减少对水的重吸收，同时可以减少集合系统能量消耗，有利于移植肾功能的恢复。【关键词】大鼠；肾移植；急性排斥；水通道蛋白【Abstract】Objective To study the change of aquaprorin2(AQP2)mRNA in the graft of the rat renal transplantation model,especially after the acute rejection.Methods Normal Wistar rats’renals were selected as control group,Wistar rats acting as both donors and receptors were selected as syngeneic control group,and SD rats acting as donors but Wistar rats acting as receptors were selected as allogeneic acute rejection group〔given cyclosporine A(CsA)〕and allogeneic immunosuppression group(without given CsA).All rats were male.RTPCR method was applied to test the change of AQP2 mRNA expression of each group.Results The AQP2 mRNA expression in allogeneic acute rejection group was decreased significantly compared with that of other three groups(P<0.05).Compared with control group,the AQP2 mRNA expression in both syngeneic control group and allogeneic immunosuppression group had no significant change(P＞0.05).Conclusions Downregulation of AQP2 mRNA may reduce reabsorption of water and energy consumption in collecting duct of renal transplant in acute rejection phase,which is beneficial to the recovery of renal transplant function.【Key words】Rat；Renal transplantation；Acute rejectuion；Aquaporin肾移植术后急性排斥反应（AR）时会出现不同程度水钠平衡紊乱，而细胞代谢过程中需要的水主要通过对水分子具有高度选择性的水通道蛋白(AQP)完成跨膜转运〔1〕。在哺乳动物体内至少发现了13种AQP，其中肾脏表达的AQP种类最多。AQP2主要在肾脏的集合管表达，主要与尿液的重吸收功能有关〔2〕。肾移植术后AR时，AQP2表达降低〔3〕，但其临床意义并不明确，国内迄今未见相关报道。本实验在建立大鼠肾移植AR模型的基础上研究AR时移植肾AQP2 mRNA表达的变化，并分析其改变的临床意义。1材料与方法1.1材料与试剂雄性Wistar大鼠体重250～300 g，由吉林大学基础动物实验室提供；雄性SD大鼠200～250 g，由北京维通利华实验动物有限公司提供。显微外科手术器械(上海手术器械厂)，手术显微镜(苏州医疗器械总厂)，常规手术器械若干，10%水合氯醛，肝素等渗盐水等。TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0购于大连宝生物有限公司，PCR特异引物由上海生工合成：AQP2上游引物：5′TGTGGGAACTCAGATCCATAG3′，下游引物：5′AGGCTCTGAGGAGAGTGGA3′，扩增产物长度为791 bp；做为内参的βactin上游引物：5′AAGAGAGGCATCCTGACCCT3′，下游引物：5′TACATGGCTGGGGTGTTGAA3′,扩增产物长度为218 bp。1.2方法1.2.1手术及动物分组利用显微外科技术动脉端端吻合、静脉Cuff套管吻合、输尿管端端吻合建立大鼠肾移植模型。正常雄性Wistar大鼠肾脏为正常对照组（C组）；Wistar大鼠作为供、受者建立同系基因对照组（W组）；SD大鼠为供者，Wistar大鼠为受者建立同种异体移植急性排斥组（S组）；SD大鼠为供者、Wistar大鼠为受者,术后给予环孢素（CsA）免疫抑制建立同种异体移植免疫抑制组（CsA组）。1.2.2组织处理术后5 d处死大鼠，切取移植肾，每组获得8只移植肾。PBS缓冲液漂洗冲去血液后，液氮中冻存。1.2.3 RTPCR及产物鉴定应用Trizol试剂常规提取肾组织标本总RNA，经紫外分光光度计定量后，取0.5μg总RNA，按TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒说明书进行操作，扩增条件为：94℃变性2 min,然后94℃30 s,60℃30 s,72℃60 s,共30个循环，最后72℃延伸10 min。PCR结束后取20μl产物在1%琼脂糖凝胶上进行恒压电泳，80 V,20 min；然后0.5%溴化乙锭染色20 min。用Kodak凝胶电泳成像分析系统（EDAS）进行电泳结果的拍照及条带的强度分析，以βactin作为内源性RNA参照，分别计算每一条泳道的AQP2与βactin强度比值。1.3统计学方法数据用SPSS10.0统计软件包进行单因素方差分析，实验组间差异比较采用t检验。2结果对照组、同系基因对照组、同种异体移植急性排斥组、同种异体移植免疫抑制组大鼠肾脏AQP2 mRNA的相对表达量分别为1.281±0.046、1.402±0.077、0.810±0.022、1.301±0.059。与对照组相比较，同种异体移植急性排斥组移植肾AQP2 mRNA表达显著下调（P＜0.05）；与同系基因对照组和同种异体移植免疫抑制组相比较，其移植肾AQP2 mRNA表达显著下降（P＜0.05）。同系基因对照组和同种异体移植免疫抑制组中移植肾AQP2 mRNA表达的变化与对照组相比较无统计学差异（P＞0.05），见图1。图1 AQP2 RTPCR扩增产物1.0%琼脂糖凝胶电泳结果3讨论肾移植术后AR时会出现不同程度的水钠潴留，与体内水钠平衡紊乱有关。目前认为水穿越细胞膜有两种方式：一是弥散通过脂质双分子层；二是通过细胞膜上的AQP，其介导作用在水分子的跨膜转运中占主导作用。肾脏集合系统是尿液浓缩的关键部位，AQP2是集合管上皮细胞上最重要且受血管加压素（AVP）调节的AQP，参与介导抗利尿激素（ADH）依赖的肾集合管通透性〔4〕。因此，AR时移植肾AQP2的表达会发生相应的改变〔5〕。本研究发现AR时AQP2 mRNA的表达下调。为了排除此种下调可能与缺血再灌注损伤及去神经损伤有关，本研究用近交系大鼠（Wistar大鼠）建立了同系基因对照组。近交系大鼠具有个体之间在遗传上一致的特性，保持了遗传的稳定性和遗传基因的同源性，大鼠之间MHC完全相配。因此，近交系大鼠间肾移植不会发生AR。本研究中同系基因对照组仅有2只大鼠出现轻微的排斥，这与大鼠在繁育过程中有可能出现遗传的变异或污染有关。同系基因对照组移植肾AQP2 mRNA表达的变化与正常对照组相比较无统计学差异，说明AQP2 mRNA表达下调与缺血再灌注损伤及去神经损伤及其他的手术因素无关。为了进一步证实这种下调与AR的关系，本研究建立了同种异体移植免疫抑制组。在此组中发现由于免疫抑制剂CsA的应用，组织形态学上可见的AR消失了，同时AQP2的下调也大大减轻或者完全消失，因此，本研究认为AQP2这种下调与肾移植术后AR有关。Velic等〔5〕认为集合管ADH依赖的调节水重吸收的主要靶点是AQP2，它也属于醛固酮调节载体的家族。肾移植术后AR时AQP2 mRNA表达下调，而且CsA治疗及同系基因移植后没有该变化。本研究与上述结果相同，同种异体移植急性排斥组移植肾AQP2 mRNA表达下调，与正常对照组相比较有统计学差异；而同系基因对照组和同种异体移植免疫抑制组中移植肾AQP2 mRNA表达的变化与正常对照组无统计学差异。AQP2在尿液浓缩中起到重要的作用，AR时AQP2表达下调，说明AR时集合系统的浓缩功能下降。但是，这会引起尿液重吸收的减少，对减轻AR时的水潴留有作用。Velic等〔6〕认为在AQP2表达下调的同时集合管上皮细胞钠离子通道的表达也下调，这可能是节约能量的一种保护办法，以帮助应激的器官恢复和保护移植肾免受在集合系统可见的非免疫性和免疫性损伤，有利于移植肾功能的恢复。【参考文献】1 Nejsum LN.The renal plumbing system：aquaporin water channels〔J〕.Cell Mol Life Sci，2005;62(15):1692706.2 Feraille E,Doucet A.Sodiumpotassiumadenosine triphosphatasedependent sodium transport in the kidney：hormonal control〔J〕.Physiol Rev，2001；81：345405.3 Edemir B,Reuter S,Borgulya R,et al.Acute rejection modulates gene expression in the collecting duct〔J〕.J Am Soc Nephrol,2008;19(3):53846.4 Nielsen S，Frokiaer J,Marples D,et al.Aquaporins in the kidney：from molecules to medicine〔J〕.Physiol Rev，2002；82：20544.5 Velic A,Gabriels G,Jochen R，et al.Acute rejection after rat renal transplantation leads to downregulation of Na+and water channels in the collecting duct〔J〕.Am J Transplant，2005；5:127685.6 Velic A，Hirsch JR,Bartel J,et al.Renal transplantation modulates expression and function of receptors and transporters of rat proximal tubules〔J〕.J Am Soc Nephrol，2004；15(4)：96777.