微孔板―酶标仪法在Rh阴性稀有血型库建立中的应用临床医学论文.doc

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微孔板―酶标仪法在Rh阴性稀有血型库建立中的应用_临床医学论文【关键词】微孔板建立Rh阴性稀有血型库需要从大量献血者中筛查，工作量大、检测成本较高。而检测Rh血型采用经典的试管法操作繁琐、肉眼判断结果缺乏客观性，不适合于大批量标本的检测；采用平板法也存在试验敏感性不足和不易标准化操作的缺点。针对上述缺点，笔者经反复摸索，建立了微孔板―酶标仪微量法（微板法），经常规8650份标本的检测，符合率为100%。1材料与方法1.1标本经EDTA-K2抗凝的无偿献血者全血标本。1.2试剂抗-D血型（中山生科公司）。1.3器材平底微孔反应板（国产）；ID2S-2型平板离心机；TITRAMAX 1011型振荡仪；Multis Kan MK3型酶标仪；进口微量移液器。1.4方法微板法：将抗-D血清25μl和稀释成一定比例的待检红细胞10μl加到平底微孔反应板中，用振荡仪在一定条件下振荡均匀，再经平板离心机以1000r/min，离心1min，再用振荡仪在一定条件下振荡悬浮。凝集的红细胞块散于孔底，不凝集的红细胞呈混悬状态。用酶标仪630nm波长自动扫描，获取每孔的相对透光率（Tc）。试管法和平板法同常规血型鉴定方法。2结果2.1振荡条件的选择在混匀及悬浮过程中各选8个标本（阴、阳性标本各4孔），在微孔中用上述方法加入抗-D血清和红细胞，用5、6、7档不同振幅，振荡时间分别为5、10、15、20、25、30s，振幅大小与震荡时间成反比，最终选择混匀条件6档振幅15s，悬浮条件6档振幅20s。2.2凝集试验与非凝集试验结果与透光率的关系选40个凝集（Rh阳性）和20个非凝集（Rh阴性）标本，自然沉降后取红细胞从原浓度到1∶32稀释度做倍比稀释，然后每孔按上述方法重复测3次，得到每孔的平均Tc，见表1。凝集试验中红细胞从原浓度到1∶32稀释度时与透光率呈线形关系（n=4，tr=0.98＞t0.01（4）=0.917,P＜0.01）；非凝集试验中红细胞从原浓度到1∶32稀释度时与透光率虽不是线形关系（n=3，tr=0.49＜t0.01（3）=0.959,P＞0.01），但其值在一定范围内波动，且随着稀释度的升高，透光率很快上升。红细胞在1∶8稀释度时，凝集反应和非凝集反应的Tc值相差最大。故本试验将自然沉降的红细胞按1∶8稀释后的浓度作为工作浓度。表1凝集试验与非凝集试验中RBC稀释度与透光率的关系2.3敏感性将抗-D血清倍比稀释，分别用微板法、试管法和平板法检测60份Rh阳性标本，结果见表2。微板法的敏感性略高于平板法，但低于试管法。2.4阴性反应与阳性反应参数的界定根据试验2（40份1∶8）和试验3（60份原血清）共100份Rh阳性标本的平均Tc 69.1%，s 9.2，（-2s）为50.7%。根据试验2（20份1∶8）Rh阴性标本的平均Tc 12.2%，s 2.6，（+2s）为17.4%。从而决定Tc≥50.0%为阳性，Tc≤17.0%为阴性，17%＜Tc＜50%为可疑，可疑者需用试管法重新鉴定。表2 Rh血型敏感性试验2.5影响因素为探讨溶血对本试验的影响，用蒸馏水将标本完全溶血，再配成不同浓度的血红蛋白液，用上述微板法检测透光率。得出溶血后透光率在18%~50%之间，可使Rh阳性标本的透光率偏低，可使Rh阴性标本的透光率偏高，均处于灰区，从而不能自动正确的判读结果。2.6可重复性取48份标本，按上述方法连续检测3次，36份Rh阳性标本的结果均为阳性，12份Rh阴性标本的结果也均为阴性，因此有良好的可重复性。2.7准确率8650份标本用微板法和平板法分别检测，任意一种方法检测阴性标本和微板法检测可疑标本用经典试管法复查。微板法阴性标本一次判读结果准确率100%（22/22），阳性标本一次判读出现可疑结果3例（3/8628），重复试验2例可疑结果判读为阳性，1例仍为可疑；平板法阴性标本一次判读结果准确率91.67%（22/24）。2.8精密度取12份标本，其中8份Rh阳性标本，4份Rh阴性标本，连续进行20次测试。凝集试验的s 9.5，cv 13.2%。非凝集试验的s 2.51，cv 18.2%。值均＜20%，因此该方法具有较好的精密度。3讨论本法检测Rh血型具有较好的重复性、准确性，操作简单、快速，判读结果客观可靠，原始结果也易于保存，自动化程度高，能高效筛选献血者，有利于实验室的标准化管理。本法特别适用于建立Rh阴性稀有血型库大量血液标本的筛查，可有效减少工作量和降低检测成本。