曲克芦丁对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用_医学论文作者：齐贵胜，裴素霞，任家胜【关键词】曲克芦丁；,,肝脏；,,缺血再灌注摘要：目的探讨曲克芦丁对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的影响及其机理。方法将Wistar大鼠40只随机分为假手术对照组、缺血再灌注组(I/R组)和I/R加曲克芦丁预处理组。I/R加曲克芦丁预处理组动物术前腹腔内注射曲克芦丁20 mg/kg,1次/d,连续3 d。然后制作大鼠肝缺血再灌注损伤模型，检测大鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的含量及肝组织中脂质过氧化反应产物丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量,并通过光镜观察肝组织结构的形态学改变。结果用曲克芦丁处理组大鼠血清中ALT和AST及肝组织中MDA含量明显低于缺血再灌注组(P<0.01),而肝组织中SOD含量则高于缺血再灌注组(P<0.01),与假手术组差异较小(P<0.05),肝细胞形态学异常改变较I/R组也明显减轻。结论曲克芦丁对肝脏I/R损伤具有保护作用，其机理与抑制氧自由基的生成,增强氧自由基的清除,减轻肝细胞脂质过氧化作用有关。关键词：曲克芦丁；肝脏；缺血再灌注Preventive Effect of Troxerutin Injection on the Damage of IschemiaReperfusion in Rat Liver Abstract：ObjectiveTo study the preventive effect on damage of ischemia-reperfusion in rat liver by applying Troxerutin Injection.Methods30 rats were put randomly into sham operated control(SOC)group,ischemia reperfusion(I/R)group and ischemia reperfusion+Troxerutin(I/R+Troxerutin)group.The animal model of hepatic ischemia-reperfusion was made by temporarily blocking the hepatic portal blood vessels and releasing 30 minutes later.The malondialdehyde(MDA),superoxide dismutase(SOD)in liver tissue and ALT,AST levels in the blood were determined after the liver had been reperfused for 120 minutes,the hepatic tissue was examined under light microscope.ResultsMDA,ALT,AST decreased and SOD increased significantly in I/R+Troxerutin group when compared those in the I/R group（P<0.01).The histologic changes of the liver tissue under light microscope in the I/R+Troxerutin group was more easer than in the I/R group.ConclusionTroxerutin has the ability to scavenge oxygen free radical(OFR)and to protect from the damage of ischemia-reperfusion in rat liver.Key words：Troxerutin;Liver;Ischemia-reperfusion;Oxygen free radical在复杂的肝胆手术、严重肝创伤的处理及肝移植时均不可避免地会导致肝缺血再灌注损伤(Ischemia/Reperfusion，I/R),甚至引发肝功能衰竭,而药物预适应是减轻I/R损伤的有效方法之一。芦丁(rutin)又名芸香苷,为一来源很广的黄酮类化合物。芦丁及其衍生物具有广泛的药理活性,具有降低毛细血管通透性、抗炎、抗病毒、镇痛、抗氧化及抑制醛糖还原酶等多方面作用［1，2］。临床上主要用于防治脑出血、高血压、视网膜出血、紫癜和急性出血性肾炎等。文献上对芦丁在心脑血管疾病方面的作用机制研究和探讨较多,但其是否对肝脏的缺血再灌注损伤具有保护作用目前尚未见文献报道。本实验复制大鼠肝缺血再灌注损伤模型，并应用芦丁的可溶性羟乙基衍生物曲克芦丁(Troxerutin)对动物进行术前预处理。测定各组大鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的含量及肝组织中脂质过氧化反应产物丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量,光镜检查肝细胞结构的形态学改变，观察曲克芦丁对大鼠肝脏I/R损伤的保护作用并探讨其作用机理。1材料与方法1.1材料实验动物与分组：成年健康Wistar大鼠30只,由山东大学医学院动物中心提供,体重（250±30）g,雌雄不限,随机分为3组,每组10只大鼠。①假手术对照组:（sham operated control,SOC）常规手术和术后处理;②肝缺血再灌注组:（ischemia-reperfusion,I/R，模型组）,夹闭肝固有动脉和门静脉30 min后,再灌注120 min;③曲克芦丁预处理组:（I/R+Troxerutin）术前腹腔内注射曲克芦丁20 mg/kg,1次/d,连续3 d,然后制作肝缺血再灌注损伤模型。1.2药品与试剂曲克芦丁注射液由山东华鲁制药有限公司生产（批号：A0507121；规格：60 mg/支）。试剂：血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒,均购于南京建成生物工程研究所。1.3方法1.3.1模型制作各组动物均手术前12 h禁食,不禁饮水。用1%戊巴比妥钠麻醉后固定于手术台上,常规脱毛、消毒、铺巾后,上腹正中切口,打开腹腔，分离出肝蒂,游离开肝固有动脉、门静脉和肝总管，用小血管夹同时夹闭肝固有动脉和门静脉,造成肝脏缺血。30 min后取下血管夹恢复肝脏血供,再灌注120 min后采集标本进行指标测定。1.3.2血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的活性测定分别以标准试剂盒（按照试剂盒说明书）测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的活性。1.3.3肝组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量测定颈椎脱臼法处死大鼠后,置于冰环境中,迅速切取肝组织,分析天平称取组织湿重,用蒸馏水混后制成匀浆,按MDA和SOD试剂盒操作程序进行测定MDA、SOD的含量。1.3.4肝组织病理形态学检查将大鼠以颈椎脱臼法处死后,快速取其肝组织，置于4%甲醛溶液中。将肝组织固定、脱水后，做石蜡切片，HE（苏木素－伊红）染色，用光学显微镜观察。1.4主要观察指标各组动物血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的活性及肝组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量测定结果；各组大鼠肝组织病理形态学变化。1.5统计学分析实验数据以±s表示，各组间差别的显著性用t检验判定。2结果2.1各组动物血清中ALT和AST的含量及变化情况结果见表1。表1曲克芦丁对大鼠血清ALT和AST活性的影响（略）与对照组比较，△P＜0.01，*P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.01；n=10 2.2各组动物肝组织中MDA含量和SOD活性的变化情况见表2。表2曲克芦丁对大鼠肝组织MDA含量和SOD活性的影响（略）与对照组比较，△P＜0.01，*P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.01；n=10 2.3曲克芦丁对I/R损伤肝组织形态学的影响在光镜下观察各组肝组织HE染色的切片,可见对照组肝索排列规则,肝窦不扩张。缺血再灌注组肝细胞索排列较紊乱,肝细胞出现肿胀,空泡变性和点状坏死,汇管区有较多的炎性细胞浸润。曲克芦丁预处理组表现为肝索排列较规则，散在的肝细胞肿胀变化，肝细胞损伤程度和范围明显低于I/R组，汇管区炎性细胞浸润明显减少。3讨论随着肝脏外科的不断发展,肝脏多种疾病常需暂时阻断肝血流进行手术,结束时又需恢复肝血流,形成所谓“再灌注”。在对肝缺血尤其是缺血再灌注产生的细胞损伤及功能障碍机制的研究中,氧自由基的损害作用被认为是最重要的因素之一［3~6］。据报道,肝缺血/再灌注损伤时血浆中脂质过氧化物的浓度与谷丙转氨酶活性呈密切正相关,并与肝形态学损伤的严重程度呈平行关系［7］。肝缺血再灌注可从两方面为氧自由基的产生提供了条件:(1)缺血时,线粒体呼吸链功能失调,氧被非四价还原,生成活性氧自由基。缺血时,黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶,后者在分子氧存在时(如再灌注时)催化次黄嘌呤(ATP分解的结果)代谢过程中,产生超氧自由基。(2)肝缺血再灌注期间,肝组织的代谢原料供应障碍及某些合成酶活性减弱导致SOD合成减少,以致氧自由基清除不足,血中氧自由基增多。超氧化阴离子转化形成的过氧化氢(H2O2)没被有效地清除,可以反过来抑制SOD活性,并且氧自由基可攻击酶蛋白改变对水解酶的敏感性而加速其水解,导致SOD活性进一步下降，内源性氧自由基清除剂SOD活性下降可导致氧自由基增多。再灌注时O2及金属离子供应增多,黄嘌呤氧化酶、中性粒细胞、线粒体及花生四烯酸等途径产生的氧自由基增多及SOD活性急剧下降而致的氧自由基清除下降,共同导致氧自由基明显增加［8］。细胞膜系统富含脂质和蛋白质,膜脂是膜的基本骨架,在维持细胞的正常结构和功能方面起重要作用。肝缺血再灌注期间大量氧自由基的形成可攻击膜脂的主要成分是多聚不饱和脂肪酸,发生一系列氧化连锁反应,即脂质过氧化反应，造成肝细胞生物膜的严重损伤并形成脂质过氧化反应产物丙二醛(MDA)。随着细胞生物膜的损伤,亚细胞器的结构亦遭破坏,导致肝细胞损伤和血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)升高。文献报道,芦丁是一种天然的抗氧化剂,能对抗自由基活性，对O-2有很强的清除作用,其清除效率可达96%以上［9］。芦丁作为Fe2+螯合剂,能抑制Fenton(芬顿)反应和脂质过氧化的链式反应而具有明显的抗脂质过氧化作用［10］。芦丁还能够明显增强过氧化物歧化酶SOD的活性［11］，提高清除自由基的活力。本实验表明,与对照组比较，I/R组各项检测指标都有显著性差异（P<0.01），表明造模成功。与I/R组比较，曲克芦丁预处理组大鼠血清中的ALT、AST活性显著降低（P<0.01），肝组织MDA的含量显著降低（P<0.01）,肝组织SOD的活性显著升高（P<0.01），肝组织损伤程度和范围明显低于I/R组，提示曲克芦丁能够对抗自由基活性，加速自由基的清除,减少脂质过氧化的发生,从而稳定肝细胞生物膜结构,减轻自由基对肝组织细胞的损害作用，对肝缺血/再灌注损伤具有保护作用。参考文献：［1］韩英华，秦元璋.芦丁研究现状［J］.山东中医杂志，2003，22(10)：635.［2］龙全江，杨韬.芦丁的研究概况及展望［J］.中国中医药信息杂志，2002，9(4)：39.［3］Kirschemer R E.Role of iron and oxygen2 derive free radicals in ischemia－reperfusion injury［J］.J Am Coll S urg,1994,103.［4］程斌.肝脏的缺血再灌注损伤［J］.中华器官移植杂志，1992，13(1)：47.［5］Kunz R,Brune HA,ZieglerU,et al.Ischemia-reperfusion damage of the liver caused by free radicals-direct detection using electron sp in resonance(ESR)［J］.L angenbecks A rch Chir,1991,376:139.［6］Kirschemer RE.Role of iron and oxygen-derived free radicals in ischem ic-reperfusion injury［J］.J Am Coll Surg,1994,179:103.［7］王万铁，徐正，林丽娜，等.脂质过氧化反应在家兔肝缺血再灌注损伤中的作用［J］.中国应用生理杂志，1998，14(3):214.［8］刘明林.缺血再灌注损伤与氧自由基［J］.天津医药，1993，9：570.［9］夏维木，陈杞，陈士明，等,应用ESR技术观察芦丁对O-2的清除作用［J］.第二军医大学学报，1997，18(4):388.［10］卢明珍，卢彦珍，王黎敏.芦丁对大鼠缺血再灌注心肌保护作用的研究［J］.山西临床医学杂志，1999，8(1):10.［11］李莲花，金泰日，金香子，等，芦丁对体外培养肝细胞的影响［J］.中国中医药科技，1999，6（2）：96.
