珍稀药源植物蛇足石杉（千层塔）研究进展_药学论文作者：马小军，闫志刚，田夏红，袁经权，冯世鑫【摘要】千层塔由于其治疗老年痴呆等疾病具有特殊的药用价值和潜在的巨大经济价值，正日益受到国内外的关注。该文综述了近年来国内外对千层塔的生物学特性、资源分布、内部显微结构、繁育、石杉碱甲提取分离及药理等方面的研究现状，并提出一些建议，对未来千层塔的研究进行了展望。【关键词】千层塔；资源；繁育；石杉碱甲；药理作用Abstract：Qian Ceng Ta,a traditional Chinese medicine,whole plant of Huperzia serrata(Thunb.ex Murray)Trev.,a member of the Huperziaceae family,has attracted intense attention since huperzine A(HupA)was isolated originally from it in the 1980s,marked anticholinesterase activity.in recent years,HupA has been marketed in China as a new drug for Alzheimer’s disease(AD)treatment and its derivative ZT-1 is being developed as anti-AD new drug candidate both in China and in Europe.This article summarizes the progress in biological characteristics,natural resources,microstructure,propagation of Huperzia serrata,extraction,isolation and pharmacological action of HupA in recent years.Key words：Qian Ceng Ta;Natural resources;Propagation;Huperzine A;Pharmacological action蛇足石杉Huperzia serrata(Thunb．ex Murray)Trev．，又名千层塔、蛇足草、宝塔草等，为石杉科石杉属蕨类植物，主布东北、长江流域和闽、粤、桂、滇、黔等省区。民间常将全草入药，有毒，用于退热、止血、消肿散毒［1］。1972年中国科学院上海药物研究所首次报道该植物中的生物碱石杉碱甲(Huperzine A，HupA)在动物实验上有松弛横纹肌的作用之后，又证明HupA是具有低毒、高效、可逆和高选择性等优点的乙酰胆碱酯酶抑制剂，对于治疗重症肌无力、中老年痴呆及提高记忆力具有良好的疗效［2］，并对抑制有机磷酸中毒有一定的作用［3］。由于其独特的药用价值，千层塔正日益受到国内外学者的重视。目前国内外多家制药厂生产石杉碱甲制剂，石杉碱甲制剂和即将上市的希普林对医药原料石杉碱甲的需求和潜在需求极大地带动了石杉碱甲的市场需求。由于合成石杉碱甲成本高昂，化学合成尚无法实现产业化，故导致了千层塔资源长期紧缺，价格不断攀升，2006年千层塔药材干品涨至25元/kg，2008年初甚至一度突破40元/kg。由于千层塔独特的药用价值，已日益受到国内外学者的重视。为更好地研究和开发千层塔资源，本研究对近年来国内外对千层塔各方面的研究进行了系统的综述。1生物学特性及资源分布1.1生物学特性千层塔为多年生土生草本植物，全体暗绿色，茎直立或斜生，高10～30 cm，中部直径1.5～3.5 mm，枝连叶宽1.5～4.0 cm，2～4回分叉，枝上部常有芽胞，叶螺旋状排列，疏生，平展，狭椭圆形，向基部明显变狭，通直，长1～3 cm，宽1～8 mm，基部楔形，下延有柄，先端急尖或渐尖，边缘平直不皱曲，有粗大或略小而不整齐的尖齿，两面光滑，有光泽，中脉明显，薄革质。孢子叶与不育叶同形，孢子囊生于孢子叶的叶腋，两端露出，肾形，黄色，成熟易裂开，孢子同形。气微，味苦［4，5］。千层塔孢子萌发后，形成配子体（原叶体），小型，结构简单，生活期较短，为30 d左右。成熟的配子体为不规则的块状体，贴在土的表面上，通过苗根作用取得营养。它的配子体为绿色，能独立生活，在配子体上面产生颈卵器和精子器。配子体产生的精子和卵在有水的环境下受精。受精卵发育成胚，幼胚暂时寄生在配子体上，长大后配子体死亡，孢子体即行独立生活。幼孢子体的顶端先长出一片幼叶，随着幼苗的长大，相继长出新叶，等到幼苗长到2～3cm时，开始出现二叉分枝［6］。1.2资源分布及生境千层塔及其种下变异类型广布于亚洲、大洋洲、中美洲、俄罗斯、太平洋等地。在我国，除西北地区部分省区、华北地区外均有分布，尤其在中国东部和东南部，形成了该种种下变异和多度中心［5,7］。在中国，除东北地区降水稍低外，年降水量1 000 mm的等降水量线十分精确地描绘出千层塔地理分布的北、西界轮廓。千层塔作为一种下层草本种群，通常分布在天然常绿阔叶林和季风常绿阔叶林及其退化的次生生态系统中，常见的生境为林缘、沟边、石上阴湿处。适合千层塔生长的土壤为沙壤、轻壤［7］。植株生长极为缓慢，配子体和孢子体阶段均需要与土壤中的特定真菌共生，形成菌根才能生长［6］。李沛玲等［8］对浙江及邻近地区的蛇足石杉7个种群的自然环境进行野外观察研究，结果表明，蛇足石杉种群多分布于海拔350～1 700 m的山地密林下或沟谷阴湿土中，郁闭度、年均降雨量、空气相对湿度均较大；环境中土壤含水量为10％～30％，pH值4.57～5.3l，电导率0.061～0.385 ms cm-1，有机质含量6.18％～9.75％；千层塔对K、Ca、Zn和Na的需要程度较高，对Pb、Cu、Cd 3种重金属元素的富集能力较强；环境条件对蛇足石杉中HupA含量有较大的影响，郭水良等［9］的研究也证实了这一点。2显微结构观察千层塔的根为不定根，生于茎基部。不定根和真菌共生，其真菌的菌丝侵入根的皮层细胞间隙中，而不侵入细胞内，为外生菌根［6］。千层塔的根只具有初生结构，由外至内为表皮、皮层和维管柱3个部分［6］。其根尖分为3个部分：分生区、伸长区和成熟区。在分生区的先端具有3个大型的薄壁细胞，可能起着代替根冠的作用；在分生区顶端组织中具有活动中心；在成熟区没有根毛，而是被真菌代替；根系活力不强，与一般的植物如玉米、绿豆等相差近3倍［6］。千层塔的茎尖从纵切面看，具顶端分生组织、叶原基、孢子原基、幼叶和茎轴［6］。千层塔的茎分为表皮、皮层和中柱3部分。表皮为一层排列紧密的细胞，横切面观近长方形或长方形，外被角质层，表面光滑，具保护作用。皮层宽，包含有多种组织，茎中近表皮部分的薄壁组织细胞具叶绿体，能进行光合作用；内皮层为一层薄壁细胞；内外皮层之间的皮层细胞为大型的薄壁细胞，其细胞内含有生物碱结晶。属于原生中柱，随着植物的发育成熟，由幼嫩茎中的星状中柱过渡到老茎中的编织中柱。木质部为外始式并为多原型［6］。千层塔的叶表皮细胞排列紧密整齐，外被较薄而平滑的角质层［6］。上表皮细胞内含有生物碱结晶，气孔分布于上下表皮［4］，为无规则型，4～6个与表皮细胞大小、形状相同的细胞无规则地围绕着保卫细胞，无副卫细胞［6］。成熟的千层塔孢子为囊肾形，黄色，单生于叶腋间，其表面具网状纹饰，网眼不规则，网脊弯曲。孢子同型，四面体型，辐射对称。孢子极面观为钝三角形，三边略内凹或平直；赤道面观为超半圆形。周壁具小孔穴，外壁光滑，表面具条脊状突起［4，6］。3繁育技术研究千层塔在野生条件下通过孢子和生殖芽繁殖。但孢子萌发周期长，萌发后属地下生配子体，需6～15年才能成熟，还有报道说从孢子萌发到植株成熟需要15～20年。野外观察发现，千层塔通过生殖芽繁殖的现象也很少，极大地限制了千层塔野生资源的再生［10］。目前，国内外对石杉科植物的组织培养研究较少。沈晓霞等［11］对千层塔进行了组织培养，研究发现，由于存在内源真菌，千层塔茎尖外植体的灭菌十分困难，需要进行多次灭菌，很难获得成功，换土栽培也不易成活。近年来，国外专家Wojciech Szypula［12］等发现有一种真菌可以促进蛇足石杉组培苗的生长，组培取得初步成功。李娜等［13，14］对千层塔进行了扦插试验，研究表明高浓度的萘乙酸对千层塔的发根不利；高浓度的吲哚丁酸十分利于发根；已经萌芽的插条的生根率、平均生根量和平均根长等指标明显高于不萌芽插条，而且死亡率较低；腐殖土+河沙(1∶1)混和土壤为基质的各项数据表明，生根率、平均生根量、平均根长和根分叉率都比河沙与腐殖土单独作基质的高。4石杉碱甲研究石杉碱甲（HupA）在我国首次由徐择邻教授从华南马尾杉中分离得到。石杉科植物中很多种都含有HupA，均是HupA的药物资源，但以蛇足石杉的含量相对较多，活性最好，已被广泛地应用于临床［15］。4.1提取分离工艺研究由于石杉碱甲在千层塔中的含量极低且价格昂贵，所以提取方法的选择尤为重要。石杉碱甲提取的传统方法有酒石酸浸泡、盐酸渗漉、Soxhlet抽提以及用乙醇回流提取等。但是，这些方法的缺点是耗时、得率低以及杂质较多。近年来，微波协助提取(MAE)中草药及天然产物有效成分的研究已有报道，查圣华等［16］利用微波协助提取石杉碱甲和石杉碱乙，取得了很好的效果，3次重复实验所得石杉碱甲和石杉碱乙回收率分别是93.7％和93.9%，与传统的回流提取工艺相比，过程时间从2h缩短为90s，回收率提高了10%以上。另外，查圣华等［17］室温下超声提取石杉碱甲和石杉碱乙，不仅缩短了提取时间，从原来的2 h缩短为15 min，减少了提取步骤，降低了溶剂耗量，而且使石杉碱甲和石杉碱乙回收率达到了97.3％。一般的溶剂萃取、硅胶柱层析等方法进行分离，虽然能获得少量产品，但费时且得率低，难以规模化生产［18，19］。沈生荣等［19］则巧妙地利用HupA在不同pH值下存在形态的变换特性，系统研究了HupA高效提取的分离纯化技术，结果表明：pH对HupA的存在形态有很大影响，利用变换pH的办法去除杂质效果理想；适量的活性炭及适宜的吸附时间和溶液浓度除杂效果显著；低温下氯仿的重结晶可得到纯度大于99%的高纯度HupA。陈建华等［20］则利用高速逆流色谱技术成功地从千层塔提取物中分离制备了纯度高于98%的石杉碱甲单体，并找到了合适的两相溶剂体系n-Hexane／n-BuOH／H2O(4∶1∶5，V／V／V)。目前在药物分析方面，毛细管电泳（CE）技术，因其分离性能高、分析速度快、超微量进样、几乎没有废液，特别是无需考虑复杂组分对价格昂贵的色谱柱引起污染的特点，也越来越受到药物研究工作者的重视，有望成为未来石杉碱甲分离测定的更有效途径。A.Ben Hameda等［21］使毛细管电泳测定石杉碱甲通过试验设计和人造神经系统网络的结合使用得到进一步优化，优化条件为醋酸缓冲液50 mM，pH 4.6，分离电压为10 kV，水力注入时间为10s，温度为25℃。4.2含量测定利用高效液相色谱法（HPLC）测定千层塔中石杉碱甲含量，简单、准确、选择性高［22］。孙远明等［23］采用HPLC法测得蛇足石杉中HupA的含量约为0.2‰，含量明显高于储滨孟等［24］用高效薄层扫描法测定的蛇足石杉中HupA的含量0.066‰。顾月华、孙远明等［23，25，26］利用HPLC测定比较植物不同药用部位石杉碱甲的含量，结果表明，叶中HupA含量最高，茎次之，根最低。另外，研究得出不同产地HupA含量有一定差异，而提取方法之间差异不显著［18，23］。估计蛇足石杉全草中HupA含量还随季节变化［18］。5药理研究千层塔始载于《植物名实图考》，性味辛、苦、平，具有散瘀消肿，解毒，止痛的功效，1985年开始用于老年性痴呆治疗研究。由于石杉碱甲的作用持续时间长，毒副反应少，受到世界各国同行的瞩目［27］，其片剂和胶囊剂已被批准上市。现在市场上以石杉碱甲为主要成分的药物有哈伯因和双益平。最近开发的石杉碱甲透皮吸收贴片已获得国家食品药品监督管理局的临床批件［28］。一些治疗AD（阿尔茨海默病、早老性痴呆）的新药也已被美国食品与药品管理部门验收通过［29］。由于石杉碱甲的特殊疗效,国内外学者对它的全合成、衍生物及类似物的合成作了大量的工作,但至今几乎没有得到活性比天然HupA更好的衍生物和类似物［30］。近年来，由我国科研人员对石杉碱甲进行了结构修饰得到的衍生物ZT-1（希普林），其活性与天然石杉碱甲非常相似，且选择性更高，毒性也更低［29］，现已在欧洲开始三期临床研究，具有良好的发展前景。Hup A的作用机理主要是通过抑制脑内AchE和加快氧自由基的清除、减少自由基损伤［15，18］。王刚等［31］研究表明Hup A可以抑制老年患者全麻苏醒期脑内胆碱酯酶活性，增加脑内乙酰胆碱含量，促进胆碱能神经功能的恢复。另外，石杉碱甲对治疗血管性痴呆安全有效，与高压氧并用疗效更佳［32，33］。研究［34］表明，维生素E与石杉碱甲合用在疗效上相辅相成，且不良反应轻，服用简单方便，易被老年患者接受，联合用药可能是以后治疗AD的方向。临床试验［35］表明，石杉碱甲对于治疗重症肌无力比新斯的明效果更明显，更具安全性。研究表明：石杉碱甲片能改善精神分裂症动物模型的认知功能，主要是通过抑制乙酰胆碱酯酶的活性和直接或间接地清除自由基来达到的［36，37］。研究报道显示，高毒性的有机磷酸类化合物对军事人员和平民都存在神经毒威胁，石杉碱甲具有抵抗有机磷酸盐中毒的作用，并减少谷氨酸诱导的细胞死亡［3，38，39］，有保护神经和预防化学武器的潜力［40］。应该注意的是，石杉碱甲可诱发部分癫痫病人癫痫发作，可能是由于石杉碱甲对胆碱酯酶的抑制作用所致［41］。6问题与展望随着老年化社会到来，痴呆症已成为人类的第四大病魔，直接导致国际市场上石杉碱甲的供应缺口越来越大，这既为石杉碱甲提供了广阔的市场前景，也加速了千层塔资源的迅速消耗。千层塔作为主要的药源植物和珍稀药材，为了保护稀缺中药资源，促进中药资源的可持续利用，对其野生资源的保护和人工栽培的研究已成为迫在眉睫的任务。据报道全国千层塔资源贮存量仅1×106 kg，广西1990年为1.77×105 kg，但目前下降至2×104 kg。并且植株中石杉碱甲含量仅十万分之五，资源的短缺引起该药材资源价格暴涨。千层塔植株矮小，生长缓慢，野生资源有限，而人工繁殖困难，组培未获成功，扦插成活率很低。因此，现阶段我国千层塔药材即便仅供国内制药企业生产石杉碱甲制剂都严重不足，更难以满足国外市场需求，而目前仅美国年需求就达100 kg，价格400万元（RMB）/kg。近年来中科院上海药物所又成功以石杉碱甲为母核开发出了希普林，2006年在欧洲完成了3期临床研究，被评价为目前抗老年痴呆症疗效最好药物，有望两年内上市。希普林一旦上市，势必更为加剧千层塔资源危机，使千层塔成为石杉碱甲制剂和希普林制剂产业链的最大瓶颈，将严重制约希普林全方位造福千千万万的全球老年痴呆患者，资源量严重短缺的问题令人担忧。迄今为止，通过生物资源获得天然石杉碱甲依然是解决药源的主要途径。解决资源再生的努力正在加速进行。据报道德国Freiburg大学成功研究了粗糙马尾杉Phlegmariurus squarrosus(Forst.)L.Love et D.Love的试管繁殖，得到比外植体或千层塔更高含量的石杉碱甲［42］，使石杉科植物的组培看到了希望。另外，发酵生产石杉碱甲有也正在加紧进行，陕西省延安大学生命科学院从湖北恩施蛇足石杉的茎部分离得到交链孢霉属真菌YD-01，杨晓军等［43］对该菌株经摇瓶发酵并分离得到石杉碱甲等化合物，为石杉碱甲的生产开辟了新的研究思路。【参考文献】［1］李建宗.湖南植物志，第一卷［M］.长沙：湖南科学技术出版社，2004：175.［2］郭水良，李沛玲，方芳，等.蛇足石杉及其近缘种表征关系的FTIR主成分分析［J］.光谱学与光谱分析,2005，25（5）：693.［3］L.S.Tonduli,G.Testylier,C.Masqueliez,et al.Effects of Huperzine Used As Pre-Treatment Against Soman-Induced 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