在头颈部鳞状细胞癌中与p53突变相关的潜在关键基因分析头颈癌被列为世界上第七大最常见的癌症死亡原因,其中头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)是最常见的亚组,尽管外科手术以及放疗和化疗方面的进展不断,但头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的5年生存率仍保持在50%至60%的水平[1]。TP53是一种众所周知的肿瘤抑制因子和转录激活/抑制因子,基因组数据显示TP53是HNSCC中最常见的突变基因[2,3]。尽管已经发展了局部晚期头颈癌的治疗方法,但是由于对标准放化疗的耐药性,侵袭性肿瘤和高失败风险的患者的治愈率仍然很差[4]。p53蛋白与治疗失败和不良的生存结果息息相关,因此研究与头颈部鳞状细胞癌p53变异相关基因对于了解其发病机制和开发新的治疗方法具有重要意义。近年来,一种名为加权重基因共表达网络分析(WGCNA)的R分析软件包被广泛地应用于高通量微阵列或RNA-seq数据集。它对低丰度或小倍数变化的基因仍具有很高的敏感性,从而达到不丢失任何信息[5]。WGCNA(weightedgeneco-expressionnetworkanalysis)软件包可用于寻找高度相关基因的聚类(模块),使用模块或模块内的中枢基因对这些聚类进行总结,关联模块与外部样本特征,以及计算模块内成员资格。WGCNA作为新的网络基因筛选方法,可用于识别候选生物标记物或治疗靶点。这种方法已成功地应用于各项生物学领域,如结肠癌、小鼠遗传学和脑成像数据分析等[6,7,8]。为了探索头颈部鳞状细胞癌中与p53变异相关基因,本研究利用WGCNA方法分析头颈部鳞状细胞癌患者的基因表达谱,构建基因共表达网络并划分基因模块,寻找与疾病临床指标相关的基因模块以及这些模块中的中枢基因,并分析这些基因的可能作用机制。1、材料和方法1.1数据的获取和预处理从GEO数据库中下载了芯片数据GSE107591。该数据基于昂飞人类基因1.0ST芯片平台(AffymetrixHumanGene1.0STArray),包含47个样本,其中24个头颈部鳞状细胞癌样本、23个正常组织对照样本。下载GSE107591的原始数据后,用R语言(版本3.5.3)中的affy包RMA法分别对两组数据进行预处理,合并数据后,用注释信息将芯片探针号转换成对应的基因符号,去除没有对应基因的探针,对于多个探针对应一个基因的情况,计算其平均表达值。1.2差异表达基因(DEGs)的筛选使用最近邻算法补充缺失值,使用limma包计算每个基因的倍数差异值(取对数变换)并推断差异发生的概率P。当倍数差异值大于0.8,且P<0.05时,即判定为差异表达基因(DEGs),从而构建基因差异表达谱矩阵。1.3WGCNA共表达网络的构建检测缺失值后进行样本层次聚类分析,观察是否有离群值样本。绘制样本树图-临床信息热图。使用WGCNA的pickSoftThreshold函数计算加权值β,该方法通过计算一组候选加权值的无标度拓扑拟合指数(1到20)来为共表达网络构建提供合适的加权值。当参考数据集的指数值超过0.8时确定适当的加权值,一旦确定了加权值,就使用WGCNA算法构建共表达模块。随后在R软件中使用blockwiseModules函数来识别共表达模块,每个模块的最小基因数设置为30,绘制共表达网络与模块之间的关系。1.4模块-临床特征关系的构建计算上述数据集中模块的模块eigengenes(即第一主成分)。用cor函数和corPvalueStudent函数分别计算模块eigengenes与临床特征之间的相关性及其P值,最后可视化每个模块和临床特征之间的相关强度。模块成员(MM)是指基因表达与模块eigengenes的相关性,而基因显著性(GS)是指基因与临床特征之间的相关性。具有高MM和高GS特征的基因分布的模块进一步说明了该模块值得深入探讨。1.5共表达模块的功能富集分析使用GO分析模块的细胞成分(CC)、分子功能(MF)、生物学过程(BP);使用京都基因和基因组百科全书(KEGG)分析模块的基因通路。提取各模块前十条结果并制表。P<0.05为差异有统计学意义。最后使用cytoscape软件将模块网络可视化,并计算模块中枢基因。2、结果2.1数据特征数据集GSE107591包含47个样本,其中24个头颈部鳞状细胞癌样本、23个正常组织对照样本。原始数据经过affy包预处理后,得到包括47个样本和19037个基因在内的表达矩阵。2.2鉴定头颈部鳞癌患者的DEGs使用绝对倍数变化大于0.8并且P<0.05鉴定了3971个基因,其中949个被上调,3022个被下调(图1)。所有探针组的火山图,见图1。图1HNSCC基因火山图2.3共表达模块的构建使用WGCNA算法将47个样本中表现出0.8倍变化的3971个基因的表达值构建共表达模块。进行样本层次聚类分析,我们发现一个明显的离群值(GSM2871777),已将其从队列中删除。在WGCNA之前,我们进行了网络拓扑分析,加权值12是规模独立性(scaleindependence)高于0.8的最低功率,选择该加权值后产生3971个基因的分层聚类树,见图2。我们确定了7个模块,大小从1307个基因(turquoise模块)到35个基因(red模块)。图2聚类树状图2.4模块-临床特征关联基于模块eigengenes和临床特征之间的相关性识别它们与模块之间的关联,见图3。结果表明,2个模块与p53变异特征显著相关:其中,蓝色模块(blue)与p53变异呈正相关,绿松石模块(turquoise)与p53变异特征呈负相关。随后,分别进一步计算正相关模块(blue)、负相关模块(turquoise)中的GS对MM。我们发现,与p53变异临床特征(GS)最显著相关的蓝色模块中的基因也是模块(MM)中最重要的元素,见图4,这表明它们不仅是头颈部鳞状细胞癌在生物学功能的关键组成部分,而且与p53变异临床特征息息相关。图3模块-临床特征关系图图4模块基因中p53突变的重要性(GS)与模块成员(MM)的散点图2.5功能富集分析分别对正、负相关模块中的基因进行GO分析及KEGG通路富集分析。蓝色模块的基因主要富含“细胞外基质组织”(P=3.07E-18)、“胶原分解过程”(P=2.54E-16),蓝色模块中顶部KEGG通路是“ECM受体相互作用”(P=1.05E-12)。绿松石模块的基因主要富含“转录、DNA模板化”(P=1.34E-10)、“转录调节”(P=1.52E-08),绿松石模块中顶部KEGG通路是“细胞黏附分子(P=2.41E-04)”,见图5。2.6模块可视化和中枢基因使用cytoscape软件使两个模块(蓝色、绿松石)可视化,计算每个基因的结节内连接性,具有高模块内连接性的那些被认为是中枢基因。蓝色模块中枢基因为TPX2,CCNB2,DLGAP5;绿松石色模块中枢基因为VWA3A,ARMC4,CFAP46,C11orf88(并列第三),见图6。图5模块中基因的GO富集分析和KEGG途径富集分析图6模块的可视化3、讨论p53主要通过诱导细胞周期停滞,凋亡和衰老来响应压力进而抑制肿瘤发生,但也有学者认为p53在细胞能量稳态和代谢中的非经典功能也正在成为抑制肿瘤的关键因素[9]。HNSCC中TP53的破坏性突变与较高的肿瘤分期,较高的淋巴结转移发生率,对放疗的抵抗和生存率降低独立相关[10,11,12]。TP53在HNSCC的50%～80%中发生了突变,但对调节p53的原癌基因的生物学和临床影响目前还了解得很少[13]。在这项研究中,我们使用WGCNA来分析头颈部鳞状细胞癌的基因组表达数据。WGCNA是一种揭示基因高阶关系的系统生物学方法。我们得到了头颈部鳞状细胞癌中与p53变异相关的7个基因共表达模块。其中我们选择了蓝色(blue)模块和绿松石(turquoise)模块来进行深入研究。蓝色模块基因主要富含“细胞外基质组织”、“胶原分解过程”,KEGG通路是“ECM受体相互作用”。蓝色模块的基因表达水平与p53变异呈正相关。蓝色模块的中枢基因为TPX2,CCNB2,DLGAP5。TPX2是目前被公认的一种癌基因,其过表达与多种癌症(如胃癌、肾透明细胞癌、宫颈癌等)的发生发展密切相关[14,15,16]。膀胱癌中的TPX2-p53-GLIPR调节通路表明TPX2激活了p53的合成;GLIPR1能抑制TPX2,同时GLIPR1被野生型p53上调,但不受突变型p53的影响[17]。在头颈部鳞状细胞癌中未发现相关报道,我们的研究中发现TPX2与p53变异呈正相关,二者在头颈部鳞状细胞癌中的调节通路还需进一步研究。细胞周期蛋白B2(CCNB2)是细胞周期蛋白家族的成员,已被发现在人类癌症中上调[18]。CCNB2的表达水平在鉴别肾上腺皮质癌中的恶性肿瘤与良性肿瘤中具有高诊断效率,其过表达也与非小细胞肺癌(NSCLC)的临床进展和预后不良有关[19,20]。文献表明,p53通过最近发现的p53-p21-DREAM-CDE/CHR途径间接抑制CCNB2的转录[21],但p53变异与CCNB2的关系未被阐明。我们的研究认为CCNB2与p53变异呈正相关,二者之间具体相互作用关系将成为我们进一步了解疾病机制的关键。HURP(又称DLGAP5/DLG7)最初被鉴定为参与肝细胞癌致癌的潜在调节基因,是一种微管相关蛋白,其功能在于诱导新的微管蛋白片形成,促进纺锤体形成,并促进通过动粒捕获纺锤体[22]。文献表明HURP的表达受甲基化调节,上调HURP水平能够促进肝癌细胞的增殖[23]。此外,Kuo等人发现敲除HURP可以通过下调p53的积累来抑制肝癌细胞的增殖[24],HURP沉默也可以使肝癌SK-Hep-1细胞对顺铂敏感[22]。我们的研究认为HURP与p53变异呈正相关,这或将成为影响放化疗疗效的重要通路。绿松石模块基因主要富含“转录、DNA模板化”、“转录调节”,天青石模块中顶部KEGG通路是“细胞黏附分子”。绿松石模块的基因表达水平与p53变异呈负相关。绿松石模块中枢基因为VWA3A,ARMC4,CFAP46和C11orf88。含血管性血友病因子A域蛋白3A(VWA3A)是一种内皮细胞表面抗原,其与p53之间的相互作用尚不明确;ARMC4是一种轴突蛋白,对于正常靶向和锚定外部动力蛋白臂而言是必需的,ARMC4突变引起原发性纤毛运动障碍,导致左/右身体不对称[25];有研究发现新型融合转录物VTI1A-CFAP46与自噬作为肝细胞癌患者潜在治疗靶点[26],但关于CFAP46及C11orf88的功能仍知之甚少。在我们的研究中VWA3A,ARMC4,CFAP46和C11orf88均与p53变异呈负相关,但上述基因与p53之间的关系均未见报道,说明这些基因是极具潜力的。我们用正相关基因(TPX2、CCNB2、DLGAP5)为代表,验证经由WGCNA筛选关键基因的可靠性。在TCGA数据库中分析上述基因在头颈部鳞状细胞癌患者癌组织与癌旁组织之间基因表达量差异,我们发现上述基因表达水平差异均有统计学意义,见图7。图7正相关模块中枢基因(TPX2、CCNB2、DLGAP5)基因表达水平(*P<0.05)综上所述,本研究从转录组数据出发,通过建立基因共表达网络并结合临床指标进行生物信息学分析,鉴定出影响HSNCC中p53变异的2个重要基因模块及其中枢基因。既往文献提示这些基因与癌症及p53相关,且我们通过TCGA数据库验证基因表达量差异后得到一致结果,证实了本方法的可靠性。这些基因将帮助进一步阐明HSNCC的分子机制,并为疾病的临床干预提供更多治疗靶点。李倩云,陈冬,黄子瑞,吴超颖,贾芳.头颈部鳞状细胞癌中与p53突变相关基因的鉴定[J].现代肿瘤医学,2020,28(17):2968-2973.基金:辽宁省自然科学基金(编号:20180550039)。
