结肠康泰对结肠炎大鼠结肠黏膜 EGFR 及 PCNA 表达的影响医学论文.doc

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结肠康泰对结肠炎大鼠结肠黏膜EGFR及PCNA表达的影响_医学论文作者：张永锋刘映芳张赵洁谭永港杨敏丁民【摘要】目的：观察结肠康泰对结肠炎大鼠结肠黏膜EGFR及PCNA表达的影响，从结肠黏膜修复角度探讨结肠康泰的药效机制。方法：雌性SD大鼠60只，随机分为4组，分别为正常对照、模型、柳氮磺胺吡啶（SASP）及结肠康泰组，以5%2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBs）诱导大鼠形成结肠炎症，免疫组化法观察EGFR及PCNA的表达。结果：结肠康泰组大鼠结肠黏膜EGFR及PCNA高表达，与模型组比较有显著性意义（P<0.05）。结论：上调EGFR表达及细胞增殖水平是结肠康泰修复结肠黏膜损伤的愈合机制之一。【关键词】表皮生长因子受体；增殖细胞核抗原；结肠康泰〔Abstract〕Objective To observe the effect of Jiechang Kangtai(JCKT)recipe on expression of EGFR and PCNA of colonic mucosa in colitis rats and explore the pharmacological mechanisms of recovery of colonic mucosa wound by JCKT recipe.Methods 60 female SD rats were randomly divided into four groups,namely normal control,pathological,solfasalazine(SASP)and JCKT groups.Experimental colitis model in rats were induced by Trinitrobenzene sulphonic acid(TNBs).The expression of EGFR and PCNA were observed by immunohistochemistry.Results The expression of EGFR and PCNA in JCKT group were higher than those in pathological group(P<0.05).Conclusion EGFR positive expression increased as well as cell proliferation,which may be one of mechanisms of recovery of colonic mucosa wound by JCKT recipe.〔Key Words〕Epidermal growth factor receptor(EGFR);Proliferating cell nuclear antigen(PNCA);Jiechang Kangtai(JCKT)在与胃肠道上皮生长、修复有关的众多生长因子中，目前研究最多、最受重视的仍是表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）及其受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）。先前研究已表明经验方结肠康泰对溃疡性结肠炎临床疗效显著[1]，本文观察结肠康泰对结肠炎大鼠结肠黏膜EGFR及增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）表达的影响，从结肠黏膜修复角度探讨结肠康泰的药效机制。1材料和方法1.1实验材料1.1.1实验动物及分组雌性SD大鼠60只，体重（200±20）g，随机分为：①正常组；②模型组；③SASP组；④结肠康泰组，每组各15只。购自广州中医药大学实验动物中心。1.1.2实验药物及试剂结肠康泰：黄芪20 g，党参20 g，白术15 g，茯苓12 g，白头翁12 g，秦皮6 g，木香10 g，地榆8 g，延胡8 g，白芍12 g，甘草3 g。由深圳市第二人民医院门诊部中药房提供。按比例将原方药物置于搪瓷药罐中，以1:10加入蒸馏水浸泡2 h，加热煮沸30 min，滤出头煎，药渣加蒸馏水适量，再煮沸30 min，滤出二煎，合并2次滤液，浓缩成200%置冰箱。柳氮磺胺吡啶（SASP），上海三维制药有限公司提供，碾磨成粉，配成浓度为40 mg/mL的混悬液；5%2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBs）购自Sigma公司；即用型鼠抗EGFR、PCNA抗体，福州迈新生物技术开发有限公司提供；即用型SABC免疫组化染色试剂盒等购于武汉博士德生物工程有限公司。1.2实验过程1.2.1造模方法[2]除正常组外，其余各组大鼠造模前禁食不禁水48 h，禁食24 h后提起鼠尾将其悬空，使挣扎以排出大肠远端的大便，共2次，每次相隔6 h以上，以氯氨酮（0.2 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，用外径为2 mm的硅胶管插入鼠肛内约8 cm，经管内注入5%2，4，6-TNBs 0.4 mL（100 mg/kg）+50%乙醇0.25 mL，约10 s灌注完毕。1.2.2动物给药正常及模型组：每只每日给生理盐水2 mL；SASP组：SASP剂量为0.8 g·kg-1·d-1；结肠康泰组：结肠康泰剂量为20 g·kg-1·d-1，从造模后第1天开始，按以上剂量给大鼠每天灌胃1次，连续14 d。1.2.3标本的采集和处理至第15天，各组大鼠禁食8 h后，用颈椎脱臼法处死大鼠，剖腹，取肛门至回盲部的结肠，沿肠系膜边缘纵形剖开，每只动物在远端结肠、横结肠和升结肠处至少各取1块组织标本（2 mm×10 mm），另于有炎症或溃疡处至少取1块组织标本，常规石蜡包埋、切片。1.3观察指标与方法免疫组化ABC法检测EGFR、PCNA表达，根据试剂盒说明书进行操作。以PBS替代一抗体作为空白对照，已知阳性切片作为阳性对照。1.4统计学处理所有数据经SPSS 10.0统计软件处理，各组资料用x±s表示，采用非参数统计方法Wilcoxon秩和检验比较各组资料间的差异，P<0.05为差异有显著性。2结果2.1判定标准2.1.1 EGFR采用半定量积分法计算染色积分，即分别对每张切片的阳性细胞及阳性细胞着色程度进行分级记分，结果以两项之和表示。阳性细胞率：每张切片检测5个视野（×400），所见的阳性细胞分为0~4级（共5级）：0级为阴性，记0分；1级阳性细胞占1%~25%，记1分；2级阳性细胞占26%~50%，记2分；3级阳性细胞占51%~75%，记3分；4级阳性细胞占76%~100%，记4分。染色强度：显微镜下观察，仅细胞核着蓝色者为阴性，细胞浆或核膜上呈棕黄色为阳性；强度分0~3级（共4级）：0级为阴性，记0分；1级为弱阳性染色，记1分；2级为阳性染色，记2分；3级为强阳性染色，记3分。2.1.2 PCNA采用增殖细胞指数表示，每张切片计算5个不同视野中1 000个细胞中的PCNA阳性细胞数，以100个细胞中阳性细胞数来表示增殖细胞指数（PCNA-labeling indices,LI）。2.2各组大鼠结肠黏膜EGFR及PCNA的表达正常大鼠结肠黏膜存在少量EGFR及PCNA标记细胞。TNBs致大鼠结肠炎模型，结肠黏膜细胞EGFR表达及PCNA标记细胞代偿性增多，经灌服结肠康泰后，EGFR表达及PCNA标记细胞显著增多，各组大鼠结肠黏膜染色积分值、增殖细胞指数的比较见表1。3讨论表皮生长因子（EGF）为生长因子家族中的主要成员，生长因子是机体自身形成的多肽物质，通过把愈合所必须的物质聚集到创伤部位和诱导新的细胞增殖，在创伤愈合过程中起重要作用。表皮生长因子受体（EGFR）属于跨膜受体酪氨酸蛋白激酶家族，它广泛分布于人体的上皮细胞膜上，其信号可介导细胞的代谢、增殖、分化、黏附、迁移等生命现象[3]。炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病，在IBD和实验性结肠炎中存在着免疫调节的缺陷，包括肠黏膜失去对肠腔的保护能力或是对肠黏膜损伤后的不适当修复，近年来研究发现，在结肠炎患者黏膜中EGF受体免疫活性明显增加，因而提示EGF在结肠黏膜的修复及防御功能中起重要作用[4]。已证明[5]，EGF的生物学效应是通过与细胞膜上的EGF受体结合而发挥作用的，EGF与IBD的发病与治疗密切相关，EGF通过激活受体控制肠细胞的增生，目前认为正常成人胃肠道黏膜EGF受体仅存在于黏膜细胞基底侧面一面，急性黏膜损伤往往是EGF受体的增加，而慢性黏膜损伤会产生一个明显的细胞谱系产生EGF。增殖细胞核抗原（PCNA）是DNA多聚酶δ的辅基，其量的变化与DNA合成一致，在细胞增殖和DNA合成过程起重要作用，能直接反映细胞增殖状态，免疫组化标记增生期细胞核染色阳性，可作为细胞增殖活性的可靠标记物，其表达上调或下调提示细胞增殖水平的上升或下降。溃疡性结肠炎属中医的“泄泻”、“久痢”、“便血”等范畴，病机以脾气虚弱、湿热内阻、气滞血瘀为主，后期可见脾肾两虚，气滞血瘀贯穿于整个病程中。结肠康泰以健脾益气、清热祛湿、凉血活血为治法，虚实兼顾，切中病机，标本兼治。本实验结果表明：结肠康泰上调结肠炎大鼠结肠黏膜EGFR的表达，黏膜细胞增殖增加，是其修复结肠黏膜损伤的愈合机制之一。【参考文献】〔1〕陈如山,张永锋,邓联民,等.结肠康泰治疗慢性结肠炎的临床研究〔J〕.内蒙古中医药,1998,3:3〔2〕张涛,谢建群.大鼠溃疡性结肠炎模型的实验研究〔J〕.中国中西医结合消化杂志,2006,14(4):240-242〔3〕杨宗保,严洁.表皮生长因子受体及其信号传导通路与胃黏膜损伤修复研究〔J〕.中医药导报,2006,12(3):66-68〔4〕虞玲华,姒健敏.表皮生长因子与炎症性肠病〔J〕.全科医学教育与临床,2006,4(4):316-318〔5〕袁庆丰,姒健敏.表皮生长因子及其受体与胃肠道疾病〔J〕.国际消化病杂志,2006,26(6):301-303。