何首乌及其混伪品序列相关扩增多态性反应体系的优化药学论文.doc

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何首乌及其混伪品序列相关扩增多态性反应体系的优化_药学论文【摘要】目的建立何首乌及其混伪品序列相关扩增多态性（SRAP）分子鉴定技术体系。方法正交优化影响SRAP-PCR的Mg2+、dNTPs、引物浓度与Taq聚合酶量。结果20μl反应体系的优化组合为：Mg2+2.5 mmol/L，dNTPs 0.4 mmol/L，引物0.35μmol/L，Taq酶1U。结论Mg2+、dNTPs、引物浓度与Taq聚合酶量对不同物种SRAP-PCR结果有不同程度影响，利用SRAP分子鉴定前应对此4因素进行优化。【关键词】何首乌混伪品序列相关扩增多态性优化Abstract：ObjectiveIn order to characterize Polygonum multiflorum Thunb.and its adulterants,the SRAP molecular marker system was established.MethodsOrthogonal design was used to optimize the concentrations of Mg2+,dNTPs,primers and Taq DNA olymerase.ResultsThe optimum system of 20μl was as follows:Mg2+2.5 mmol/L,dNTPs 0.4 mmol/L,primer 0.35μmol/L,Taq DNA polymerase 1 U.ConclusionThe concentrations of Mg2+,dNTPs,primers,Taq DNA olymerase have different effect in the result of SRAP-PCR in different species.It is necessary to optimize these four factors before using SRAP to identity different species.Key words：Polygonum multiflorum Thunb.;Adulterants;SRAP;Optimize何首乌Polygonum multilorum Thunb.是我国传统名贵中药，广东十大“道地药材”之一。近年来对其药理药效研究及开发应用越来越广。据研究报道其药用化学成分主要有蒽醌类、二苯乙烯类、芪类、多糖类等［1～4］。何首乌具有降血脂［2］、增强免疫［3］、抗氧化［4］、护脑［5］等多种药效。除入药外，还被用于制取洗发水、首乌酒、保健品、食品和饲料添加剂等，开发前景十分广阔［6］。然而，何首乌出现混伪品的历史久、地域广。本草中有混淆品宕芋的记载；河南、河北、甘肃、宁夏等地也有将翼蓼、毛脉蓼误做何首乌使用的历史［7］；湖北省武当山、竹山、竹溪、房县均有把混淆品耳叶牛皮消作何首乌使用的习惯［8］，且有不法商贩雕刻芭蕉块根为“人型何首乌”出售。混伪品的出现严重阻碍何首乌科研及应用，因此对何首乌及其混伪品的鉴定显得至关重要。序列相关扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism，SRAP)以操作简单、稳定性高、多态性丰富、易于测序［9～12］等优点在种质鉴定［13］、遗传多样性分析［11］、遗传连锁图构建［14］、基因连锁标记寻找［9］与基因的遗传变异［14，15］等方面得到广泛应用。且Ferriol等［16］发现与其它分子标记相比，SRAP在分子水平上与传统在形态学水平上建立的物种分类鉴定更加吻合。SRAP分子鉴定技术基于PCR反应。一个优化的PCR反应体系极其重要，这关乎样本DNA所能扩增的条带数、清晰度及稳定性，从而影响后续的统计分析。为建立何首乌及其混伪品SRAP分子鉴定技术，本文首次对何首乌及其混伪品SRAP-PCR反应体系的主要影响因素进行了优化，以期为何首乌及其混伪品鉴定提供前提条件。1材料和方法1.1材料实验所用引物及物种见表1～2。实验所用DNA聚合酶，TaKaRa Taq(DR001AM)。BSA（牛血清白蛋白），购自TaKaRa。表1实验所用引物（略）1.2 DNA提取用TIANGEN的DNAsecure Plant Kit提取经硅胶干燥保存的各物种叶片DNA，紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法检测DNA质量合格，稀释为50 ng/μl，-20℃保存。表2实验所用物种（略）1.3 SRAP-PCR扩增采用L16(45)正交实验设计，对总体积为20μl的SRAP反应体系中的Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq聚合酶浓度进行4因素4水平的优化分析(表3～4)，共16个处理。其它成分为：DNA模板（50 ng/）1μl、Buffer（10X）2μl、BSA（0.1%）0.2μl，超纯水补足使终体积为20μl。所用引物对为me17-em1。表3 PCR反应的因素与水平（略）扩增程序：94℃预变性5 min；95℃变性1 min，35℃复性1 min，72℃延伸1 min，5循环；94℃变性1 min，48℃复性1 min，72℃延伸1 min，35循环；72℃延伸7 min。PCR在PE-2400型PCR仪上进行。1.4 SRAP-PCR产物检测取8μlPCR产物与2μl上样缓冲液，混合后在含有0.5μg/mLEB的2%琼脂糖凝胶上电泳40 min，Bio-Rad凝胶成像系统上观察和记录结果。表4 PCR反应因素水平L16(45)正交实验设计μl（略）2结果2.1正交实验结果按表4分别对9物种进行PCR反应后，所得产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测（见图1）。图1 9物种SRAP-PCR正交电泳结果（略）根据图1电泳结果，按条带数、清晰度分别给9物种独立打分，最佳记7分，最差为1分。见表5。2.2分析对表5评分进行直观分析，各物种4因素的最佳水平、直观分析最佳组合见表6。将表5评分用统计软件SPSS V13.0进行方差分析，各物种所得结果中的F值与Sig值见表7。其中Sig<0.05代表0.05水平下差异显著。由表6可知各物种SRAP-PCR 4因素的最佳水平及最佳反应体系组合不完全相同。其中Mg2+、引物、酶的2号水平，dNTPs的3号水平相对于各因素其它水平，为最佳水平次数最多。有6物种正交16个处理中8号处理扩增结果最优。由表7可知4因素对各物种扩增结果影响显著度有差异。其中引物浓度对卷茎蓼、耳叶牛皮消、头花千金藤SRAP-PCR扩增影响不显著，酶浓度对齿叶蓼SRAP-PCR扩增影响不显著，其它情况4因素对扩增结果都具显著影响。纵观9物种，多以Mg2+影响最为显著，Sig值均在0.004以下；dNTPs显著性次之。4因素对各物种SRAP-PCR影响显著性及最佳水平均不相同，没有统一的最佳组合，因此折中选择9物种都具良好扩增的统一体系。其中正交8号处理在毛脉蓼、齿叶蓼、卷茎蓼、木藤蓼、翼蓼、耳叶牛皮消6物种SRAP-PCR扩增中都取得了最佳效果，在其余3物种何首乌、齿翅蓼、头花千金藤中也取得了仅次于最好处理的扩增效果。因此，选定8号处理（Mg2+=2.5 mmol/L、dNTPs=0.4 mmol/L、引物=0.35μmol/L、Taq酶=1U）为SRAP鉴定何首乌及其混伪品的反应体系。利用此优化条件，选用引物对me4-em5做验证实验（图2）。从电泳结果可知9物种都有较好的扩增，证明此条件可作为SRAP鉴定何首乌及其混伪品的反应体系。表5 9物种SRAP-PCR各处理扩增电泳结果得分（略）3讨论Mg2+是Taq酶的激活剂，过低不能有效激活Taq酶，过高又会抑制酶活。dNTPs是PCR反应的“原料”，在Taq酶的催化下与DNA单链模板互补配对实现PCR反应的延伸，过低量的dNTPs会使DNA扩增产量减少，电泳条带模糊，过量的dNTPs一方面会与Taq酶竞争Mg2+使Taq酶活降低，另一方面会增加错配率从而影响扩增效率。引物的浓度也要适量，过低时扩增条带较少，引物浓度过高会促使引物错误引导非特异性产物。Taq聚合酶用量的多少直接影响PCR反应的成败，酶用量过低酶活力单位少，电泳条带较暗甚至消失，酶量过高，会增加非特异性产物。因此，Mg2+、dNTPs、引物及Taq酶浓度均会影响PCR扩增的结果，在PCR时必须对其进行优化处理。单因素优化试验直观简便，结果的判断准确，但考察组合搭配覆盖面小，各因素的最佳水平组合不一定最优。正交优化更具科学性，条件覆盖面广，但在本文中条带优劣判断存在较大人为主观，增加了误差。因此，实验方法应依据实验目的进行取舍。本实验文为找到9物种的统一的良好反应体系，考察的体系组合覆盖面要广，选用了正交优化。表6各物种直观分析（略）表7 9物种方差分析（略）*表示0.05水平下显著图2 me4-em5验证实验（略）SRAP标记与已有的分子标记技术相比有很多优点。与AFLP技术相比较而言，它省去了酶切、连接、预扩增等烦琐的步骤，节约了费用和时间，同时又简便可靠，得到的目的条带便于测序。与RAPD技术相比SRAP稳定，重复性好。Budak［10］等以野牛草为材料发现SRAP比RAPD，SSR，和ISSR有更丰富的多态性和更强的区分鉴别能力。本文SRAP标记技术体系的建立将为何首乌及其混伪品鉴定奠定基础。【参考文献】［1］任丽建，金勇，尹寿玉.炮制方法对何首乌有效成分影响的研究［J］.时珍国医国药，2007，18（3）：637.［2］高王宣，胡英杰，符林春.何首乌二苯乙烯苷的调节血脂作用［J］.中国中药杂志，2007，32（4）：323.［3］葛朝亮，刘颖.何首乌多糖对免疫功能低下小鼠的免疫保护作用［J］.中国新药杂志，2007，16（24）：2040.［4］方微，张慧信，绿娅，等.何首乌总苷抗氧化与实验性小鼠主动脉粥样硬化病变的形成［J］.中国中药杂志，2007，32（13）：1320.［5］李永梅，李霞，周兆丽.何首乌提取物对百草枯引起的小鼠多巴胺神经元损伤的保护作用［J］.中国临床药理学杂志，2007，23（5）：395.［6］凌晖，曹福亮，汪贵斌，等.何首乌RAPD分析的最佳PCR条件筛选［J］.江西农业大学学报，2004，17（2）：265.［7］李军，徐国钧，徐珞珊，等.中药首乌类的研究Ⅱ.原植物调查和商品鉴定［J］.中草药，1995，26（1）∶33.［8］陈吉炎，涂汉军，陈师西，等.武当山何首乌及其混伪品的鉴定研究进展［J］.中药材，2000，23（6）：363.［9］Li G,Quiros C.F.Sequence-related amplified polymorphism(SRAP),a new marker system based on a simple PCR reaction:its application to mapping and gene tagging in Brassica［J］.Theor Appl Genet,2001,103:455.［10］Budak H,Shearman R C,Parmaksiz I,et al.Comparative analysis of seeded and vegetative 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