带有HIS标签的重组EIAV感染性分子克隆的构建动物医学论文.doc

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带有HIS标签的重组EIAV感染性分子克隆的构建_动物医学论文【中文摘要】马传染性贫血病毒（EIAV，简称马传贫）是反转录病毒科慢病毒属的成员之一，是马传染性贫血病（EIA）的病原体。我国的EIAV弱毒疫苗是迄今为止世界上唯一投入应用的慢病毒疫苗，成功地控制了我国EIA的流行。该毒株是将EIAV L株（EIAV L）通过驴体传代，使其毒力明显增强，然后在驴白细胞培养物上连续传代致弱获得的。由于我国马传贫弱毒疫苗存在野毒和疫苗毒鉴别困难的问题，目前尚未得到欧美等发达国家的认证，如要进入国际市场，急需建立一种EIAV强、弱毒快速鉴别诊断方法。目前我国使用的马传贫弱毒疫苗未进行克隆纯化，如果用带有分子标签的马传贫弱毒疫苗感染性克隆衍生的病毒作为疫苗代替现有疫苗，将有利于现地使用和推广。本研究应用已构建好的EIAV驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆载体（pOK8266）为模板，通过SOE PCR方法在感染性分子克隆载体的S2基因独特区内引入突变点，形成含有酶切位点（NspV）的突变体（P1P4）。将突变体（P1P4）亚克隆至pBluescript SK（M13-）质粒，形成pB-P1P4中间载体；人工合成两条六个组氨酸的引物，作为标签，将其插入pB-P1P4中间载体的NspV位点，形成带标签的中间载体；用ApaI酶切pOK8266和中间载体，连接转化，构建带标签的重组感染性分子病毒克隆载体（EIAV-pOK8.2-HIS），经PCR、酶切和测序表明，六个组氨酸已插入pOK8266的S2基因内。分别转染驴皮肤细胞（FDD）和驴白细胞，将转染驴皮肤细胞收获物传至第六代，电镜下未观察到EIAV病毒；而将转染驴白细胞收获物传代至第六代时，电镜下观察到了典型的病毒粒子。提取前病毒DNA，PCR扩增P1P4片段，亚克隆至pMD18-T载体，测序证明前病毒DNA含有六个组氨酸，从而在体外获得了感染性克隆病毒株。本研究通过SOE法巧妙地对S2基因引入突变，插入HIS标签，成功地获得了标记感染性分子克隆，证明S2基因缺失突变株在体外巨嗜细胞上培养不影响其复制力，为野毒株和疫苗毒的鉴别诊断打下基础。但病毒的致病性、免疫原性和标签的表达情况尚需作动物实验做进一步的探索。