小儿水杨酸苯酚搽剂的毒理学研究药学论文.doc

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小儿水杨酸苯酚搽剂的毒理学研究_药学论文【摘要】目的：为小儿水杨酸苯酚搽剂成品制剂的临床安全使用提供实验依据。方法：观察大鼠完整皮肤及破损皮肤一次性涂抹最大耐受量（MTD）的小儿水杨酸苯酚搽剂所产生的毒性反应情况，从给药0时起至7 d连续观察记录动物的急性毒性和45 d连续的长期毒性反应，以皮肤刺激反应标准进行评分作毒理等级评价；对存活动物在观察结束时进行高位脱椎处死采血检测外周血常规和血清生化，解剖后裸眼和病理切片观察心、脑、肝、肾等主要脏器的病理变化。实验数据以Bliss法处理计算LD50。结果：未测出LD50值；皮肤完好与破损组动物均产生轻度刺激反应；外周血常规和血清生化均未见明显改变；心、脑、肝、肾等重要脏器裸眼和病理切片均未见明显病理改变。结论：小儿水杨酸苯酚搽剂在小于MTD 2 000 mg/(kg·d)［40 mL/(kg·d)］剂量下一次性涂大鼠皮肤后（该剂量相当于临床剂量的800倍）以及1 000、500、200 mg/(kg·d)剂量的长期毒性试验，均未产生明显毒副反应。【关键词】毒理学急性毒性长期毒性水杨酸苯酚搽剂最大耐受量［Abstract］Objective:To provide scientific foundation for safely using Salicylic AcidPhenol Liniment.Methods:Integrated and disrepaired skins in the rats were smeared with Salicylic AcidPhenol Liniment by the maximum tolerated dose(MTD)only.The toxic reaction of the animals were observed and recorded continuously from the beginning of using the drug to 7 days,and evaluated by using the general standard of the reaction of skin stimulation in pharmacology.Animals were executed by taking off acanthi and blood was collected to check up the periphery blood routine and serum biochemistry at the end of the observation of the rats.And after the dissection,the pathological change of main visceras,such as heart,brain,liver and kidney were observed with naked eye and pathological slices.The data of this experiment was used to calculate the value of LD50 by using Bliss rule.Results:The value of LD50 was unavailable to be calculated.Lowgrade stimulation was observed in both integrated and disrepaired groups.There was no obvious changes in the periphery blood routine,serum biochemistry and pathological slices in the main visceras(heart,brain,liver and kidney).Conclusions:There are no obvious toxic reactions occurred to the rats by the doses 1 000,500,200 mg·kg-1·d-1 and smearing Salicylic AcidPhenol Liniment one time,whose dose was lower than MTD 2 000 mg·kg-1·d-1(40 mL·kg-1·d-1).［Key words］Toxicology;Acute toxity;Longterm toxity;Salicylic AcidPhenol Liniment;Maximum tolerated dose小儿水杨酸苯酚搽剂是我院临床根据小儿生理、尤其是婴幼儿病理生理特点，以《中国医院制剂规范》中“水杨酸苯酚搽剂”处方［1］为基础进行改良以适合儿童的皮肤用药要求而配制的外用制剂，对儿童体表癣具有独特的临床疗效，为临床安全有效的使用该制剂，对其进行了急性毒性试验，现将结果报道如下。1仪器与试药1.1仪器全自动血球计数仪TILH2000（法国），冰冻切片机620Eshandon（英国），OLYMPUS GX51倒置金相显微镜（日本）；DADE BEHRING DIMENSION RL全自动生化分析仪（美国），所用生化试剂均购自美国DADE BEHRING公司。1.2试验材料1.2.1试药小儿水杨酸苯酚搽剂（处方为：水杨酸50 g、苯酚10 g、花生油加至1 000 g。批号060206、060302、060307，本院制剂室提供）；硫化钠（天津大茂化学试剂厂，批号20070602）；羧甲基纤维素（湖南药用试剂厂，批号2007021）。1.2.2动物SPF级SD、Wistar大鼠，体重（200±20）g，重庆医科大学实验动物中心提供，许可证号SCXK（渝）20020001，环境设施合格证医动字第310103002号。2方法与结果2.1皮肤局部刺激强度的评价标准参照文献［2］28对皮肤局部刺激反应的评分标准，拟定本试验红斑和水肿均按4分制，最高与最低分分别是4和0分。红斑评分标准：无红斑0分，勉强可见红斑1分，明显红斑2分，中度到严重红斑3分，紫红色红斑并有焦痂形成4分。水肿评分标准：无水肿0分，勉强可见水肿1分，皮肤隆起轮廓可见水肿2分，皮肤隆起近1 mm水肿3分，水肿隆起1 mm并范围扩大4分。对皮肤刺激强度评价分为无刺激和轻、中、重度刺激4级，对应分值分别为0～0.49、0.5～2.99、3.0～5.99和6.0～8.0分。2.2完整和破损动物皮肤的急性毒性试验2.2.1完整皮肤最大耐受量的预试参考文献［2］28［3］在室温（23.5±2）℃，相对湿度40%～85%的实验室中，取SPF级SD大鼠10只，雌雄各半，试验前24 h用10%硫化钠溶液脱毛剂脱去背部约为体表面积10%的毛发，禁食、自由饮水12 h后，参考临床常用剂量0.05 mL/(kg·d)［以5%水杨酸苯酚搽剂（g/g）的水杨酸计为2.5 mg/(kg·d)］作为初始预试量涂搽试验大鼠的脱毛皮肤处，并以初始剂量的2、4、8、64、256和1 024倍［即为5、10、40、640、2 560 mg/(kg·d)］的剂量进行反复预试验，结果在2 560 mg/(kg·d)以下未见明显异常反应。2.2.2 LD50及MTD的测定取SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，试验前24 h用10%硫化钠溶液脱毛剂涂抹试验大鼠背部约为体表面积的10%，脱去毛发后立即用（37±3）℃的清水冲洗净残留脱毛剂，正常饲养至试验前12 h禁食、自由饮水，按每组10只随机分为6组，以2 560 mg/(kg·d)为最大试验剂量，按1∶0.7的比例设计5个分组试验剂量，分别为2 560、1 792、1 254、878、615 mg/(kg·d)，按每只大鼠每次最大给药容积2 mL/只的实验设计，制备25%小儿水杨酸苯酚搽剂浓缩储备溶液，根据试验设计要求各取设计量的储备溶液用羧甲基纤维素混悬液配制成2 mL，分别一次涂抹大鼠无毛处皮肤，然后用纱布和油纸包扎，固定24 h后去除，同时进行阴性（羧甲基纤维素组）对照试验。从试验开始后连续观察10 d，主要观察其皮肤毛发的变化、呼吸情况、自主活动、行为改变、皮肤刺激反应、眼睛、粘膜、体重变化、中枢神经系统及其他中毒表现等指标的变化情况，按“2.1”皮肤刺激反应评分标准记分进行评价。结果除在最高剂量组有1只死亡外，其余各组均未发现有死亡和特别异常的试验大鼠，将试验动物死亡率折算为死亡单位。参考文献按改进Bliss法：LD50=lg-1［Xmi(∑p0.5)］(g/kg)SX50=i×∑p-∑p2n-1 LD50的95%置信限=lg-1（X50+1.96S×50）由以上计算式分别得LD50及95%的可信限见表1。由于未测出LD50值及其95%置信限，参考文献［2］230、［3］及本试验结果，可认为小儿水杨酸苯酚搽剂皮肤给药的最大耐受量（MTD）为2 000 mg/(kg·d)。表1 SD大鼠皮肤一次性涂抹小儿水杨酸苯酚搽剂后的毒性反应（略）2.2.2皮肤刺激试验取SPF级SD大鼠40只，雌雄各半，随机分为4组，每组10只。（1）完好皮肤对照组：供羧甲基纤维素行完整皮肤阴性对照试验；（2）破损皮肤对照组：用大头针均匀划破皮肤为＃字形，以渗血为准，造成损伤性皮肤，供羧甲基纤维素行皮损空白试验；（3）破损皮肤试验组：用大头针均匀划破皮肤为＃字形，以渗血为准，造成损伤性皮肤，供小儿水杨酸苯酚搽剂行皮损试验；（4）完好皮肤试验组：保持完整皮肤供小儿水杨酸苯酚搽剂试验。按“2.2.2”的方法分别给试验组大鼠以40 mL/(kg·d)［2 000 mg/(kg·d)］剂量一次性涂抹小儿水杨酸苯酚搽剂，然后用纱布和油纸包扎（24 h后用温水洗净受试药物的给药部位），在给药后0、1、3、6、12、24、48、72 h至第7 d，每日观察并记录试验动物的生理活动，结果各组试验大鼠的体重、皮肤、毛发、眼粘膜的变化、呼吸、中枢神经系统、四肢活动等表现正常，试验组与对照组之间体重变化差异无统计学意义（χ2=9.86，P=0.6127），均无动物死亡，并按“2.1”皮肤刺激反应评分标准记分定量评价（见表2）。试验结束时将各试验组与阴性对照组大鼠颈椎高位脱位处死并立即解剖，裸眼仔细观察心、脑、肝、肾、肺、脾等重要器官的改变。2.2.3外周血常规（1）检测指标：红细胞、血红蛋白、平均红细胞体积、血小板计数、白细胞、平均血红蛋白量、红细胞压积、平均血红蛋白浓度、红细胞分布宽度、血小板平均体积、淋巴细胞绝对值、中性粒细胞绝对值、中间粒细胞绝对值、淋巴细胞百分比、中性粒细胞百分比等。（2）检测方法：仪器法。结果见表3。表2 SD大鼠皮肤一次性涂抹小儿水杨酸苯酚搽剂的皮肤刺激试验（略）表3小儿水杨酸苯酚搽剂一次性涂抹SD大鼠外周血常规结果（略）2.2.4血清生化（1）检测指标：总胆红素、直接胆红素、总蛋白（TP）、白蛋白（ALP）、球胆白、谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）、谷草/谷丙比、碱性磷酸酶（AKP）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、谷氨酸氨基转移酶（AST）、乳酸脱氢酶、血糖、甘油三酯（TG）、尿素氮（UREA）、肌酐（CREA）、尿酸等。（2）检测方法：所有酶类生化指标均采用速率法，尿素采用尿酶法，肌酐采用苦味酸终点法，尿酸采用尿酸酶紫外法，总蛋白采用双缩脲法，白蛋白、球蛋白采用溴甲酚绿法。结果见表4。表4小儿水杨酸苯酚搽剂一次性涂抹SD大鼠皮肤后的血清生化结果（略）*GPT项与对照组比较P<0.05，其余各项与对照组比较P>0.05 2.3病理组织切片及分析所有急性毒性试验大鼠在试验观察结束后颈椎高位脱位处死，仔细裸眼观察有无明显病理改变，随即采集心、肝、肾、肺、脾等重要脏器置于福尔马林溶液中固化24 h，切成组织小片，再经12 h固化，以不同浓度乙醇梯度脱水（8 h）后浸蜡2 h，干燥后置于冰冻切片机上切片，经二甲苯脱蜡，37℃干燥后经HE染色、封片，制作好病理切片后置于生物显微镜（ZEIS AXLOSKOP 400）下，在40～100倍视野下观察病理改变。裸眼仔细观察心、脑、肝、肾、肺、脾等重要器官未见明显异常改变，100倍生物显微镜下病理切片见图1～4。2.4长期毒性试验［2］202［3、4］取体重为200 g的Wistar大鼠40只，雌雄各半，随机分为4组，每组10只，常规饲养7d，经查血常规及肝、肾功能正常后供试验。参考SD大鼠的MTD值并以其0.50、0.25、0.10倍设计3个剂量组：1 000、500、200 mg/(kg·d)和1个羧甲基纤维素对照组，按“2.2.2”的方法，分别给各试验组Wistar大鼠用药，对照组给予同体积的羧甲基纤维素，每天定时给药一次，用油纸包扎脱毛处皮肤3 h，连续45 d。每天给药后仔细观察各动物的活动：外观体征、行走情况、饮食、粪便、尿液等有无异常，每天按时测定体重一次，并根据大鼠体重变化调整给药量。纪录各项观察指标，给药结束时及停药14 d各剂量组随机取1/3的动物在DADE BEHRING DIMENSION RL全自动生化分析仪上进行血液学的红细胞、白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞等外周血象的常规检测和肝、肾等重要器官的生化指标监测（包括TP、ALP、AST、ALT、GPT、GOT、AKP、血糖、TG、CREA、UREA等）。结果外周血象正常，生化除GPT高剂量组有明显升高外（P<0.05），其余各组与对照组比较均无显著变化（P>0.05），见表5。另将中途死亡或检测结束的动物迅速剖取心、肝、脾、肺、肾、脑、子宫、睾丸等器官，肉眼观察有无异常。并对各组的心、肝、肺、肾、脾等脏器进行病理组织切片检查，结果高剂量组的各重要脏器均未见明显的组织病变。图1小儿水杨酸苯酚搽剂一次按MTD剂量涂抹大鼠破损皮肤后的心肌病理切片(4×10)（略）图3小儿水杨酸苯酚搽剂一次按MTD剂量涂抹大鼠破损皮肤后的肾组织病理切片(10×10)（略）图2小儿水杨酸苯酚搽剂一次按MTD剂量涂抹大鼠破损皮肤后的肺组织病理切片(10×10)（略）图4小儿水杨酸苯酚搽剂一次按MTD剂量涂抹大鼠破损皮肤后的肝组织病理切片(4×10)（略）表5 Wistar大鼠皮肤涂抹小儿水杨酸苯酚搽剂45 d的生化指标检测结果（略）*GPT项与对照组比较P<0.05，其余各项与对照组比较P>0.05 3讨论小儿水杨酸苯酚搽剂由水杨酸、苯酚、花生油等多种成分配制而成的复方外用搽剂，具有良好的杀菌、抑制霉菌、溶解角质脓痂的作用，常用于黄癣、脓痂疹、毛囊角化症及鱼鳞癣等多种皮肤病。其处方中主药成分为水杨酸，浓度为5％（g/g），为便于本试验设计试验剂量均以水杨酸的量作计算和设计。由于动物体表面积不便直接测定，按文献对体表面积与体重进行近似换算体表面积［2］：A=R·W2/3，其中，A为动物体表面（m2），W为体重（kg），R是动物的体型系数，参考文献［2］（大鼠）本实验取0.09，从而获得相对准确的动物试验剂量。为便于文字表达，本文试验剂量均以公斤体重剂量表示。本试验结果表明，小儿水杨酸苯酚搽剂在剂量2 000 mg/(kg·d)（该剂量相当于临床剂量的800倍）给大鼠一次涂搽皮肤后完好皮肤可出现红斑、轻微水肿等轻度刺激反应，3～5 d内可恢复正常。该剂量对破损皮的刺激反应稍强，皮肤划伤处有红斑、水肿等刺激反应出现，皮肤再次长毛时间较空白试验组平均晚1～2 d，在5～7 d内均可恢复正常。以上剂量虽对破损的皮肤刺激反应稍强，但评分仍在轻度刺激反应范围，均可在5～7 d内恢复。该剂量无论给完整或破损皮肤大鼠一次涂搽，均未对其体重、眼、粘膜、呼吸、中枢神经系统、四肢活动等产生明显影响和全身中毒反应，外周血常规和血清生化也未见明显改变；心、脑、肝、肾等重要脏器裸眼和病理切片均未见明显病理改变。Wistar大鼠长期毒性试验以SD大鼠的MTD值并以1 000、500、200 mg/(kg·d)等3个剂量连续45 d的长期毒性试验，结果外周血象和肝肾功能及重要脏器等无明显变化，表明该制剂是安全的。【参考文献】［1］中华人民共和国卫生部药政局.中国医院制剂规范［M］.第1版.天津:天津科技翻译出版公司,1989:8788.［2］徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学［M］.第3版.北京:人民卫生出版社,2002:28230,202.［3］张均田.现代药理实验方法学（下册）［M］.北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1998:18141820.［4］周立国,刘泰然,郑春敏,等.便乃通对大白鼠的长期毒性试验研究［J］.华西药学杂志,2001,16(3):184.