六味地黄方对慢性铝暴露痴呆大鼠记忆功能保护作用的研究临床医学论文.doc

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六味地黄方对慢性铝暴露痴呆大鼠记忆功能保护作用的研究_临床医学论文【摘要】目的研究六味地黄方对慢性铝暴露痴呆大鼠记忆功能的保护作用及其机制。方法采用胃肠道慢性染铝的方法制备记忆功能障碍大鼠模型，用Morris水迷宫实验检测大鼠空间学习记忆能力，并通过对血浆中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的测定，研究慢性铝暴露导致大鼠记忆功能损害及六味地黄方的干预机制。结果与正常对照组相比，模型组大鼠学习记忆能力降低(P<0.01，P<0.05)，血浆MDA水平增加而SOD活性减低(P<0.01，P<0.05)。与慢性铝暴露模型组相比，六味地黄方能提高大鼠血浆中SOD活性，降低MDA含量，改善了慢性铝暴露大鼠学习记忆功能(P<0.01，P<0.05)。结论六味地黄方通过增加体内抗氧化酶的活性，降低慢性铝暴露导致的神经脂质过氧化反应，从而干预慢性铝暴露对大鼠记忆功能的损伤。【关键词】六味地黄方;慢性铝暴露;老年性痴呆;脂质过氧化;水迷宫【Abstract】Objective To explore the effects of Liuweidihuang on memory function of rat with chronic aluminum exposure and its mechanism.Methods Aluminum toxic model rats were produced by gastrointestinal tract of AlCl3.Morris water maze test，plasma chemistry index superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA)were used to measure the memory function and its mechanism.Results Compared with control group,the memory function decreased,the MDA level was increased and the SOD activity was decreased in model group.Compared with model group,SOD activity was increased and MDA level was decreased,the memory function was improved in Liuweidihuang group.Conclusions Liuweidihuang can prevent the rat from chronic aluminum damage by increasing antioxidation enzyme activity and decreasing neuronal lipid peroxidation reaction.【Key words】Liuweidihuang;Chronic aluminum exposure;Alzheimer′s disease(AD);Superoxide dismutase(SOD);Malondialdehyde(MDA)阿尔茨海默病(AD)，是老年期最常见的中枢神经系统退行性病症之一，主要表现为学习记忆功能障碍和行为异常。近年研究证实，慢性铝暴露是导致AD的主要环境因素之一〔1〕。自由基所造成的脂质过氧化损伤可能就是慢性铝暴露发挥神经毒性作用的重要途径〔2〕。因此具有抗氧化功能的药物常被用来对抗铝中毒导致的神经损伤。但是常用的合成抗氧化剂在动物模型实验中被发现有毒副作用，所以寻找安全、有效的抗氧化干预手段成为防治铝中毒的研究热点。六味地黄方为历代医家用于延缓衰老的代表药，其单味药中含有较强的抗氧化成分。因此，开发利用以六味地黄方为代表的天然植物药作为抗氧化剂，可能是防治慢性铝暴露导致AD的有效途径。本实验通过观察六味地黄方对慢性铝暴露痴呆大鼠血浆中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量及Morris水迷宫空间学习记忆的行为学影响，为抗氧化类天然植物药治疗AD提供实验依据。1材料与方法1.1动物和试剂健康清洁级雄性SD大鼠40只，鼠龄10个月，体重450～550 g(由中国人民解放军军事科学院实验动物中心提供)。AlCl3·6H2O(MV254，由天津市耀华化工厂提供)，柠檬酸三钠(MV294.10，由天津市化学试剂一厂提供)，SOD、MDA(由南京建成生物工程研究所提供)，Morris水迷宫测试系统(RB100A，由北京新天地科技有限公司提供)。1.2动物分组及模型的制备将大鼠按体重随机分为4组：正常对照组、模型组、六味地黄方低浓度组(低浓度组)、六味地黄方高浓度组(高浓度组)，每组10只大鼠。正常对照组大鼠每天自由摄食普通饲料，其余大鼠每日摄取的鼠粮为普通饲料中加入结晶氯化铝，剂量为Al3+10 mg/kg。为促进铝的吸收，加铝饲料中按1∶11加入柠檬酸三钠。为排除柠檬酸盐的影响，正常对照组大鼠进食的普通饲料中也加入等量柠檬酸盐。取熟地黄24 g、山药12 g、山茱萸12 g、泽泻9 g、茯苓9 g、牡丹皮9 g，制成浓度为1.0 g/ml的六味地黄生药。正常对照组大鼠与模型组大鼠每天2 ml/只生理盐水灌胃，六味地黄方低浓度组大鼠每天2 ml/只六味地黄生药灌胃，六味地黄方高浓度组大鼠每天4 ml/只生药灌胃。各组大鼠均喂养6个月。1.3大鼠血浆SOD和MDA水平的测定大鼠喂养6个月后，经内眦静脉取血0.2 ml，离心取上清液，所测指标按南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书进行测定。1.4大鼠空间学习记忆功能的Morris水迷宫行为学检测Morris水迷宫为一个直径150 cm、高50 cm的黑色圆形铁桶，注水至深度16.5 cm左右，实验过程中水温保持在(26±1)℃。因测试对象为白色SD大鼠，测试环境背景为黑色，因此在水中放入碳素墨水，混匀，使水不透明。在水池内设两条虚拟垂直线，将水池均分为4个象限，分别为NE(第Ⅰ)、SE(第Ⅱ)、SW(第Ⅲ)及NW(第Ⅳ)象限，在SW(第Ⅲ象限)正中距池壁30 cm处放一个直径10 cm、高15 cm的圆形黑色平台，平台平面低于水平面1.5 cm左右，Morris水迷宫实验分为定位航行实验和空间探索实验两类。定位航行实验用于检测大鼠的学习能力，连续训练4 d。训练第一天，撤掉水池中平台，让大鼠自由游泳(NE象限入水)2 min，观察大鼠游泳的速度及姿势，剔除不合格的大鼠。从第2天起放入平台，每天分上午、下午两个时间段(间隔8 h)对每只大鼠分别进行训练。分别从4个坐标象限内标定的入水点将大鼠面向池壁放入水中，观察并记录大鼠寻找并爬上平台所需时间(即逃避潜伏期)及直线搜索策略变化的趋势。空间探索实验考察大鼠对平台位置的记忆能力。定位航行实验后，即在第5天上午，撤去平台，取NE(第Ⅰ)象限为入水点，将大鼠面向池壁放入水中，记录其在120 s内游泳时各象限的记忆频度、时间分布及第一环点数。1.5统计学处理所有数据均用SPSS15.0统计软件包进行处理，数据以x±s表示。2结果2.1大鼠血浆SOD活性、MDA含量的测定结果见表1，与正常对照组比较，模型组大鼠血浆SOD活性明显下降、MDA含量显著增高(均P<0.01);与模型组比较，六味地黄方低浓度组、高浓度组SOD活性增高，MDA含量明显下降(均P<0.05);与正常对照组比较，六味地黄方低浓度组及高浓度组大鼠SOD活性下降、MDA的含量增加(P<0.05)。结果表明，慢性铝暴露能够导致大鼠血浆SOD活性下降、MDA含量增加，六味地黄方具有提高铝暴露大鼠血浆SOD活性、降低MDA含量的作用。表1各组大鼠血浆中SOD、MDA水平的比较与正常对组比较：1)P<0.01，2)P<0.05;与模型组比较：3)P<0.05 2.2 Morris水迷宫定位航行实验结果表2显示各组大鼠在定位航行实验中的潜伏期变化过程。在整个训练过程中，正常对照组、六味地黄方低浓度组和高浓度组大鼠学习能力始终好于模型组。表2各组大鼠定位航行实验潜伏期比与正常对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01;与模型对照组比较：3)P<0.05，4)P<0.01，下表同在训练的第一时段各组大鼠逃避潜伏期没有显著差别，随着训练次数的增加，正常对照组、六味地黄方低浓度组和高浓度组大鼠潜伏期呈现稳定性下降，并且趋势明显。模型组大鼠潜伏期下降趋势缓慢，而且在训练过程中潜伏期下降有波动。全部大鼠在最后三个时间段潜伏期趋于稳定。比较各个时间段潜伏期的均值，从第二个训练时段开始模型组大鼠的逃避潜伏期明显高于正常对照组，两组差异有显著性(P<0.01);六味地黄方低浓度组和高浓度组大鼠与慢性铝暴露模型组大鼠比较也有明显差异(P<0.05，P<0.01)。与正常对照组相比，六味地黄方低浓度组和高浓度组大鼠逃避潜伏期时间延长(P<0.05)。全部大鼠在第4天都可在规定时间内找到平台。以上实验结果表明，慢性铝暴露损害了大鼠学习功能，六味地黄方可以改善慢性铝中毒对大鼠学习功能的损害。大鼠训练过程中搜索策略的变化趋势见表3，六味地黄方低浓度组和高浓度组大鼠学习能力明显好于模型组。正常对照组、六味地黄方低浓度组和六味地黄方高浓度组大鼠出现直线式搜索策略的时间较早，在训练的第3个时段，正常对照组、六味地黄方低浓度组和高浓度组大鼠已多次直线航行，而此时模型组大鼠直线搜索策略不明显。全部大鼠在第4天均能在规定时间内找到平台，分析各个训练时间段大鼠直线搜索的平均次数，正常对照组、六味地黄方低浓度组和高浓度组大鼠比模型组大鼠增多，差异有显著性(P<0.05，P<0.01)。说明在学习训练过程中，正常对照组、六味地黄方低浓度组和高浓度组大鼠学习记忆能力好于慢性铝暴露模型组。2.3大鼠空间探索实验结果各组大鼠在4个象限游泳的时间及所在象限百分比，见表4。正常对照组、六味地黄方低浓度组和高浓度组大鼠在平台象限游泳点数及所占时间百分比高于模型组，差异有显著性(P<0.01)。与正常对照组相比，六味地黄方低浓度组和高浓度组大鼠在平台象限游泳点数及所占时间百分比有所下降(P<0.05)。与模型组大鼠(1.83±0.83)相比，六味地黄方低浓度组(10.67±2.67)和高浓度组(9.33±2.78)大鼠在第一环的游泳点数显著高于模型组(P<0.01)。与正常对照组(13.50±1.33)相比，六味地黄方低浓度组和六味地黄方高浓度组第一环游泳点数下降(P<0.05)。表3各组大鼠直线搜索策略的变化趋势表4各组大鼠空间探索试验结果3讨论慢性铝暴露是导致AD的主要环境因素之一，铝对神经系统的损伤与其促进脂质过氧化反应有关〔3〕。慢性铝暴露导致记忆功能障碍的机制可能与铝增强过渡态金属对机体的氧化损伤有关〔4〕。铝可以与Fe2+竞争性地和铁蛋白及载铁蛋白结合，而使细胞中游离的Fe2+增加，Fe2+可使细胞膜的脂质过氧化增加，SOD减少，特别是增强铁催化的活性氧类(ROS)自由基的生成和脂质过氧化过程，对神经细胞产生毒性作用，导致神经系统细胞结构和功能受损，从而影响学习和记忆功能〔5〕。长期以来，传统中医药学在防治疾病和健身益寿方面发挥了积极的作用，六味地黄方为历代医家用于延缓衰老的代表药。六味地黄方的单味药中含有较强的抗氧化成分，如丹皮中主要含有丹皮酚和多种苷，山茱萸中苷类含量较高，茯苓中含大量糖类，而酚类、苷类、糖类为天然植物中抗氧化活性较强的物质，因而六味地黄方具有较强的抗氧化能力〔6〕。六味地黄方的降血脂、清除自由基的作用已初步显示了对神经损伤的防治作用。六味地黄丸可减少老年小鼠脑部MDA的含量，六味地黄煎剂可使家蝇脑中脂褐素含量降低，SOD和蛋白质含量升高，显著延长家蝇的寿命。六味地黄方剂可明显增强小鼠血中SOD和GSHPx活性，使脂质过氧化反应下降。另外，长期给予六味地黄丸可提高快速老化模型小鼠记忆获得和保持能力，改善其空间记忆能力。六味地黄丸还能明显提高小鼠血浆VitC含量，间接地帮助机体修复由各种原因生成过多的生物分子自由基。同时由于VitC能使VitE恢复原来活性，从而可以协同维持膜结构的完整性，流动性以及稳定性〔7〕。本研究中，六味地黄方可显著提高大鼠血中SOD活性，并使MDA含量明显下降。结果证实六味地黄方可以增强机体对自由基的清除能力，由此阻断自由基的连锁反应，预防自由基的损伤，六味地黄方能明显减少大鼠血浆中MDA含量，其作用途径除了抑制自由基反应外，还可能与该方促进GSHPx催化分解脂质过氧化物有关。通过以上作用，六味地黄方减轻了自由基对机体的损害，保证了生物膜的完整性、通透性，从而对防治神经退行性病变起到了十分重要的作用。总之，六味地黄方可以改善慢性铝暴露对大鼠学习记忆的损害，通过缩短学习过程，促进记忆保持、改善搜索策略，来弥补慢性铝暴露对大鼠智能的损害。本研究认为，开发利用以六味地黄方为代表的天然植物药作为抗氧化剂是防治慢性铝暴露导致记忆损害的有效途径。【参考文献】1 Rodella LF，Ricci F，Borsani E，et al.Aluminum exposure induces Alzheimer′s diseaselike histopathological alterations in mouse brain〔J〕.Histol Histopathol，2008;23(4)：4339.2 Philip T，Michael F.A review of genome mutation and Alzheimer′s disease〔J〕.Mutagenesis，2007;22(1)：1533.3 Khanna P，Nehru B.Antioxidant enzymatic system in neuronal and glial cells enriched fractions of rat brain after aluminum exposure〔J〕.Cell Mol Neurobiol，2007;27(7)：95969.4 Esparza J，Gomez M，Rosa Nogues M.Melatonin reduces oxidative stress and increases gene expression in the cerebral cortex and cerebellum of aluminumexposed rats〔J〕.J Pineal Res，2005;39(2)：12936.5 Takada J，Kaneko N，Yasui H,et al.Memory deficit in mice administered aluminummalt late complex〔J〕.Bio metals，2006;19(1)：839.6虞学军，林齐鸣，曹小玉.近年研究六味地黄方剂的文献分析〔J〕.中国中医药信息杂志，2002;9(3)：878.7周晓峰.补肾中药对自由基的消除作用〔J〕.浙江中医学院学报，2003;27(3)：879.