基于烟草的抗氧化能力的提升进行二穗短柄草BdDREB1-like基因过度表达的研究二穗短柄草是一种与拟南芥有类似优势且与小麦、大麦以及草坪草、牧草的亲缘关系比水稻更近的新型模式植物,是冷季型禾本科早熟禾亚科中唯一完成全基因组测序的植物[1,2],具有基因组小、生命周期短、自花授粉、易培植等诸多优点。因此,以二穗短柄草为模式植物,利用比较基因组学及功能基因组学方法获得二穗短柄草中重要基因的相关信息,必将加速牧草、草坪草与麦类作物的遗传改良进程。由于目前生态环境恶劣,外界低温、干旱和盐害等一些非生物胁迫是造成农作物和农副产业减产,甚至绝收的主要原因[3]。研究表明,温带及寒带植物遭受这些胁迫时,不是通过被动的防御,而是通过主动的应答机制来抵御胁迫[4]。如植物遭受冷胁迫时,是通过主动的冷驯化机制来抵御低温胁迫的。防御过程中,机体会产生一系列形态、生理生化和分子水平上的适应性变化,如改变膜系统稳定性、积累可溶性蛋白和小分子渗透物质、激活响应信号通路中起关键作用的转录因子等[4,5]。AP2/EREBP转录因子超家族是一个庞大的基因家族,在植物生长发育[6,7]以及逆境应答[8,9,10,11]通路中扮演着极其重要的角色,是作物基因的优良候选资源。AP2/EREBP转录因子成员在拟南芥中有145个[12]、水稻中有163个[13]。前期在二穗短柄草中对该超家族进行了鉴定与表达分析,从中鉴定出159个AP2/EREBP成员,可分为4大类,即:AP2(23个)、RAP、ERF和CBF/DREB[14]。CBF/DREB亚家族在应答植物低温、干旱和高盐胁迫过程中起着重要作用[9]。拟南芥中该家族包含干旱与高盐诱导的CBF/DREB2和冷诱导的CBF/DREB12个小家族[15]。其中CBF/DREB1小家族成员通过结合COR、DHN及RD等低温应答基因启动子区域的DRE/CRT顺式作用元件,激活这类基因的表达,从而提高植物的抗寒性[16]。除了模式植物拟南芥之外,人们也从水稻[17]、大麦[18]、小麦[19]和梅花[20]等多个物种克隆出了CBF/DREB基因。目前对二穗短柄草CBF/DREB1小家族的CBF1[21]和CBF3[22]在提高植物抗冷、干旱方面的研究已有报道,但对二穗短柄草中CBF/DREB1小家族成员在提高植物抗氧化方面的研究尚未见报道。本研究前期利用实时荧光定量技术检测了CBF/DREB1小家族中的BdDREB1-like基因在几种非生物胁迫条件下的表达模式,发现该基因在氧化胁迫(H2O2)下诱导表达较显著,因此,本研究将其构建到改造过的pBI121植物表达载体上,并通过农杆菌介导法转化烟草,进而对其功能进行验证。该研究将为进一步研究和解析禾本科植物CBF/DREB转录因子的功能提供一定的理论依据,对培育禾本科作物抗逆新品种具有一定的科研价值。1、材料和方法1.1试验材料、菌株与试剂二穗短柄草和烟草材料为系统生物学研究院保存。大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1、T载体、反转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司;农杆菌感受态细胞EHA105购自上海士锋生物科技有限公司;TRIzol试剂购自Invitrogen公司;胶回收试剂盒、Marker和质粒提取试剂盒购自天根生化科技有限公司;PrimeSTAR高保真酶、限制性内切酶和T4DNA连接酶购自TaKaRa公司;pBI121载体为系统生物学研究院所保存;引物合成与测序均在苏州金唯智完成。1.2BdDREB1-like基因的克隆及植物表达载体构建将成熟饱满的二穗短柄草种子剥皮后小心播种于含有3层纱布与营养液的培养皿中,并置于25℃培养室进行培养。取生长14d、状态良好的二穗短柄草幼苗,利用TRIzol试剂对其总RNA进行提取,按照康为世纪公司的反转录试剂盒进行cDNA第一链的合成。根据BdDREB1-like基因(登录号:XM_003570049)核苷酸序列,利用PrimerPremier5软件设计3条巢式引物:DREB1F、DREB1R和DREB1Rc,对其进行PCR扩增、目的片段连接、大肠杆菌Trans1-T1转化与测序。测序正确的克隆提取质粒,并命名为pBdDREB1-like-T。然后分别对pBdDREB1-like-T质粒和改造的植物表达载体pBI121-GFP进行XbaⅠ和BamHⅠ双酶切、目标片段回收与大肠杆菌Trans1-T1转化,PCR和酶切检测后阳性菌液送往苏州金唯智测序并提取质粒。测序成功的植物重组表达载体pBI121-BdDREB1-like-GFP转入农杆菌感受态细胞EHA105中,检测正确的阳性菌株用于后续植物材料的转化。1.3BdDREB1-like基因的生物信息学分析利用NCBI中的在线开放阅读框分析工具ORFfinder对测序得到的BdDREB1-like核酸序列进行开放阅读框分析;利用ExPaSy预测BdDREB1-like蛋白的理化性质;利用Cell-PLoc2.0进行亚细胞定位预测;利用InterPro进行保守结构域分析;利用Clustalx[23]进行多序列比对并利用Mega6[24]进行进化分析。1.4转基因烟草植株的获得及亚细胞定位分析把构建好的植物重组表达载体pBI121-BdDREB1-like-GFP转入农杆菌感受态细胞EHA105中,经菌落PCR检测正确后采用叶圆盘法对烟草进行遗传转化,进而获得烟草转化材料。具体过程如下:将长势良好的烟草组培苗叶片切成0.5mm大小的叶圆盘,25℃暗培养3d,置于含有重组质粒pBI121-BdDREB1-like-GFP的农杆菌EHA105侵染液中侵染6～8min,期间不停摇动三角瓶,使农杆菌充分接触叶片。完成侵染后,多余的菌液用无菌滤纸吸干,然后将其放于铺有无菌滤纸的共培养基上(MS+6-BA(2mg/L)+NAA(0.2mg/L)+Agar(8g/L)+蔗糖(30g/L),pH值5.8)25℃暗培养3d,再移到分化培养基(MS+6-BA(2mg/L)+NAA(0.2mg/L)+羧苄青霉素Cb(500mg/L)+卡那霉素kan(100mg/L)+Agar(8g/L)+蔗糖(30g/L),pH值5.8)上,待分化的幼芽长到2～5cm时将其切下转入含有500mg/L头孢霉素的1/2MS生根培养基上进行生根。待其根系发达后便可移栽至营养小钵中,提取基因组DNA,并利用BdDREB1-like基因引物DREB-F(5′-ATCATCAAGCCCGGAGCAA-3′)和DREB-R(5′-CAAGTATCCCTGCATCCCAAA-3′)进行阳性苗检测,扩出的目标条带大小为137bp。最后把收获的转基因T0种子,次氯酸钠消毒后,播于含有合适卡那霉素浓度(100mg/L)的MS培养基上进行筛选,以用于后续的试验。亚细胞定位的分析过程如下:在载玻片上滴一滴含有10%甘油的无菌水,然后将筛选为阳性的烟草幼苗的根放于上面,轻轻盖上载玻片,并保证操作过程中载玻片和盖玻片之间无气泡产生,然后置于荧光显微镜下观察野生型和转BdDREB1-like植株中是否有绿色荧光。1.5转基因烟草植株非生物胁迫处理分别在MS培养基上含有10μmol/LH2O2的培养基上萌发野生型和表达量较高的2株转基因株系的种子,21d左右观察其表型。同时将T2转基因烟草的2个转基因株系与野生型种子播种于MS培养基上发芽。待发芽14d左右,将长势一致的转基因烟草和野生型烟草同时移栽到营养钵中,按时浇水。1个月后对其进行MV(模拟氧化胁迫的甲基紫精)处理,处理7d后,测定H2O2、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和叶绿素含量。其中H2O2、CAT、POD、SOD按照南京建成生物工程研究所的试剂盒操作说明书进行。丙二醛含量测定参照Heath和Packer[25]的方法进行。取野生型和转基因烟草正常生长和氧化处理条件下的少许叶片,用pH值7.8的50mmol/L磷酸缓冲液在研钵中研磨叶片,随后把研磨液转入50mL离心管中,并用磷酸缓冲液多次冲洗研钵使其定容至10mL;9487r/min高速离心10min后,取1.5mL上清液(对照为1.5mL蒸馏水)并加入0.5%的硫代巴比妥(TBA)溶液摇匀后沸水浴中煮沸30min,然后取出冷却后6000r/min离心10min;取上清在532,600,450nm波长处分别测定其吸光度值。丙二醛含量的计算公式为:MDA=(6.542×(D532-D600)-0.559×D450)×VT/VS×FW(VT:提取液的总体积;VS:测定时用的体积;FW:样品质量)。叶绿素的含量测定分别参照李飞鸿等[26]的提取方法进行。每个品系试验重复3次。对所取得的数据采用MicrosoftExcel进行统计分析,显著水平为0.05。2、结果与分析2.1BdDREB1-like基因的克隆与序列获得以二穗短柄草叶片cDNA为模板,通过RT-PCR扩增,在琼脂糖电泳凝胶上可以扩增出一条在500～800bp的特异条带(图1)。将其切胶回收后连接至pEASY-Blunt-T载体上,并转入大肠杆菌中,菌落PCR阳性的菌株拿去测序,测序结果显示,扩增片段与目标片段大小相同,获得的含有DREB1-like基因的重组质粒被命名为pBdDREB1-T。序列分析结果表明,该基因开放阅读框684bp,编码228个氨基酸,只含有一个AP2结构域,根据前人以及系统生物学院研究院团队对AP2/EREBP亚家族的分类特点,发现该基因属于AP2/EREBP的DREB亚家族。图1DREB1-like基因的PCR扩增(A)、结构(B)与重组载体(C)2.2BdDREB1-like基因的生物信息学分析蛋白质在线分析软件Protparam分析结果显示,BdDREB1-like蛋白的预测分子量为24.178ku,等电点5.87,不稳定系数53.6,属于不稳定蛋白。蛋白的亲水/疏水性预测分析结果表明:BdDREB1-like蛋白含有24个碱性氨基酸残基和28个酸性氨基酸残基,脂肪系数为57.84,平均亲水系数(GRAVY)为-0.486,因此,该蛋白很可能为一种亲水蛋白。跨膜结果分析显示,BdDREB1-like蛋白无跨膜区,无信号肽序列,为非分泌蛋白。将BdDREB1-like基因编码的氨基酸序列在NCBI进行BlastP搜索查找其同源的蛋白序列,选取黑麦、大麦、小麦、小米、水稻、筇竹、慈竹、玉米、黍、高粱10个与其同源性较高的蛋白序列以及模式植物拟南芥的AtDREB1A(Q9M0L0)序列进行多序列比对(图2),结果显示:BdDREB1-like蛋白与黑麦ScCBFI-1、大麦HvCBF1、小麦TaCBF和OsDREB1G具有较高的相似性,序列一致性分别为95.00%,91.78%,91.10%,91.10%。其次与筇竹CtCBF1、慈竹BeCBF1、玉米ZmDREB1A、高粱SbDREB1G、小米SiDREB1G、黍PmDREB1G-like蛋白的序列一致性分别为:87.67%,89.73%,88.33%,87.50%,87.90%和87.30%。而与拟南芥的AtDREB1A的同源性最低,序列相似性仅为78.31%。采用邻位相连法构建进化树。如图3所示,二穗短柄草DREB1A-like基因编码的氨基酸序列与早熟禾亚科的小麦、大麦和黑麦属于同一个进化支,亲缘关系最近,然后与其他禾本科植物聚为一大支。2.3植物重组表达载体的构建、转基因烟草植株的获得与分子鉴定用XbaⅠ和BamHⅠ酶分别双酶切重组质粒pBdDREB1-T改造的植物表达载体pBI121-GFP,回收目的片段,经菌落PCR和测序正确后,获得植物表达载体pBI121-BdDREB1-GFP(图1-C),然后将该重组质粒转入农杆菌EHA105中,经菌落PCR检测正确的再通过叶圆盘法转化烟草。转BdDREB1-like基因的烟草经卡那霉素筛选后共得抗性苗17株,移栽后剩余12株成活;随机挑选7株提取其和野生型烟草基因组的DNA,其中以野生型烟草作为阴性对照进行PCR鉴定。BdDREB1-like基因的烟草中有5株扩增出预期大小一致的目的条带(137bp),表明BdDREB1-like基因已整合到烟草基因组中(图4-A)。从初步筛选得到的阳性植株中随机选出3株提取RNA,以反转录获得cDNA为模板,利用RT-PCR进一步检测,结果显示转基因的烟草有2个株系能扩增出预期大小目的条带(图4-B),说明BdDREB1-like基因不仅整合到烟草基因组中而且还能稳定表达。图2BdDREB1-like蛋白与其他物种DREB/CBF蛋白的氨基酸比对图3多个物种DREB/CBF蛋白的系统进化分析2.4BdDREB1-like基因的亚细胞定位Cell-PLoc2.0亚细胞定位预测显示BdDREB1-like基因定位在细胞核中,为了进一步确认BdDREB1-like基因是否定位在细胞核中,利用荧光显微镜观察了转空载体、转BdDREB1-like基因的烟草植株的根系发现转空载体的烟草植株根细胞的细胞核、细胞质、细胞膜上都能观察到绿色荧光;转BdDREB1-like基因的烟草植株根细胞只有细胞核上能观察到绿色荧光(图5)。这些结果表明,BdDREB1-like基因的确实定位在细胞核中。图4BdDREB1-like基因T0转基因烟草的PCR检测(A)与RT-PCR检测(B)2.5转基因烟草的抗氧化性鉴定由于前期分析BdDREB1-like基因表达谱时,发现其受氧化胁迫诱导,因此把转BdDREB1-like基因的烟草在未处理的MS培养基以及含有10μmol/LH2O2的MS培养基上,进行种子萌发,以观察转BdDREB1-like基因的烟草和WT烟草在未处理和氧化胁迫处理培养上的发芽情况。结果表明,在MS培养基上,播种21d后,野生型转BdDREB1-like基因烟草种子的发芽率没有显著的差异。在含有10μmol/LH2O2的MS培养基上,播种21d后,相对于野生型烟草种子,转BdDREB1-like基因烟草种子具有较高的发芽率(图6)。为了进一步确定BdDREB1-like基因与氧化胁迫的关系,又对1个月大的转基因烟草进行MV(模拟氧化胁迫的甲基紫精)处理,并测定H2O2(以鲜质量计)、过氧化氢酶(CAT)(以鲜质量计)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)(以鲜质量计)、丙二醛(MDA)(以鲜质量计)和叶绿素的含量。结果表明,在正常生长条件下,T3转基因株系除了SOD含量显著高于野生型中的含量外,以上测定的其他各种生理指标均与野生型无显著差异,T1转基因株系中的POD含量显著高于野生型中的含量,叶绿素含量显著低于野生型中的含量,其他生理指标与野生型中的无显著差异。在氧化胁迫处理条件下,转BdDREB1-like基因的烟草植株相对于野生型,具有较高的过氧化物酶活力、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和叶绿素的含量(图7)和较低的丙二醛和过氧化氢含量。结果表明,过表达BdDREB1-like基因增强了植物对氧化胁迫的耐受性。图5BdDREB1-like基因在烟草根中的亚细胞定位图6野生型(WT)烟草和转基因株系氧化胁迫处理后的发芽情况图7转基因植株(T1,T3)和野生型烟草(WT)生理指标分析不同字母表示同一胁迫条件下不同植株材料间的差异显著。3、讨论与结论植物在生长过程中,经常会受到低温、干旱、高盐等恶劣环境所带来的影响。植物遭受这些胁迫时一般会产生大量的活性氧(ReactiveOxygenSpecies,ROS),进而对植物造成氧化胁迫。而植物体内含有的种类繁多的转录因子家族,在抵御逆境胁迫方面扮演者重要角色。其中,AP2/EREBP转录因子超家族在植物中成员数目较多,它不仅参与调控植物的生长发育[6,7],也在逆境应答、植物激素信号转导等过程中发挥着重要作用[8,9,10,11]。第1个AP2/EREBP转录因子成员是1994年在模式植物拟南芥中被分离鉴定出来的,它主要调控花的发育过程[27]。之后相继从水稻[17]、大麦[18]、小麦[19]和梅花[20]等多种其他植物中克隆出来了DREB转录因子,很多研究表明,DREB转录因子是通过特异结合下游调控因子的DRE顺式作用元件进而调控其下游靶基因的表达,进而增强植物多逆境胁迫的耐受力[28]。如拟南芥中的DREB1A/CBF3、DREB1B/CBF1和DREB1C/CBF2能快速响应冷胁迫刺激,过表达这3个基因的任何一个均能提高植物对干旱、盐及冷的耐受力,而过量表达AtDREB2A基因的拟南芥只显著增强了干旱能力[29]。过表达AtDREB1A基因的菊花相对于野生型,通过降低植物叶片的电解质泄露而提高了植物的成活率[30]。过表达绿豆DERB基因的拟南芥对干旱和盐的耐受能力有所提高,而拟南芥的其他性状没有明显变化[8]。过表达短柄草CBF/DREB的CBF1[21]和CBF3[22]提高了植物的抗冷、干旱特性方面的研究已有报道,但对短柄草CBF/DREB成员在提高植物抗氧化方面的研究尚未见报道。本研究克隆了CBF/DREB亚家族的BdDREB1A-like基因,将其过表达到烟草中,发现转BdDREB1A-like基因的烟草相对于野生型具有较低的MDA和过氧化氢含量,和较高的POD、CAT、SOD和叶绿素含量。MDA是反映机体抗氧化潜在能力的重要参数,其含量的高低直接反映了细胞膜受损害程度的大小。CAT和POD具有清除H2O2的能力,SOD是氧自由基的自然天敌,是机体内氧自由基的头号杀手,它能及时清除植物体内的氧自由基,是植物逆境中最主要的一种抗氧化酶,SOD活性的高低与植物体的抗逆性密切相关。转BdDREB1A-like基因的烟草,相对于野生型烟草具有较高的POD、CAT、SOD含量,表明该基因的转入提高了植物对氧化胁迫的耐受力,在植物响应逆境胁迫过程中发挥着重要作用,因此有望用于植物遗传改良工程。参考文献：[1]李平,朱伟然,严学兵,王成章,何云,雒爱玲,徐兵,杨玲玲.新的禾本科模式植物——二穗短柄草[J].草原与草坪,2008(6):69-74.李论,柯杰,黄钢,刘红诗,宋燕妮,张英洁,陈利红.过表达二穗短柄草BdDREB1-like基因提高烟草的抗氧化能力[J].华北农学报,2020,35(02):1-8.基金:国家自然科学基金青年科学基金(31601995).
