千金藤属植物地不容和云南地不容中多糖和葡聚糖的含量测定药学论文.doc

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千金藤属植物地不容和云南地不容中多糖和葡聚糖的含量测定_药学论文作者：利奕成，杨珂，黄立，樊化，张美英，王一飞【摘要】目的千金藤属植物具有良好药用价值，许多研究表明其含有丰富的生物碱成分，但对该属植物其他成分的研究很少。对千金藤属植物非生物碱成分的组成和活性的研究，有利于更加深入地了解该属植物的药效和药理作用。方法从防己科千金藤属植物地不容Stephania epigeae H.S.Lo及云南地不容Stephania yunnanensis H.S.Lo中，采用苯酚硫酸测定法、铜试剂沉淀测定法分别测定地不容和云南地不容中的总多糖和葡聚糖的含量。结果地不容和云南地不容中分别含有25.14％，13.66％的总多糖及1.00％，0.71％的葡聚糖。结论苯酚硫酸法和铜试剂沉淀法联合使用，为该植物多糖的分离纯化及多糖成分的结构、活性研究提供可行手段。千金藤属植物的葡聚糖具有免疫促进作用，提示可对地不容的多糖成分做活性筛选研究。千金藤属植物的药用价值较高，目前对地不容的生物碱成分研究比较透彻，但对其非生物碱成分研究仍处于空白，此项研究将有助于推动其药用价值的开发。【关键词】地不容；云南地不容；多糖；葡聚糖；含量测定Content Determination of Polysaccharides and Glucans in Stephania epigeae H.So.Lo and Stephania yunnanensis H.S.Lo.Abstract：ObjectiveStephania is valuable in officinal using.It was indicated in many researches that Stephania contents is plenty of alkaloid.Other compositions have scarcely been studied.The study on non-alkaloid compositions would help us to comprehend its pharmic effects.MethodsExtracted polysaccharides from Menispermaceae Stephania epigeae H.S.Lo and Stephania yunnanensis H.S.Lo.Determined the contents of total polysaccharides and glucans.ResultsThe results of experiments indicated that there were 25.14%total polysaccharides in Stephania epigeae H.S.Lo and 13.66%in Stephania yunnanensis H.S.Lo.,while 1.00%glucans in Stephania epigeae H.S.Lo and 0.71%in Stephania yunnanensis H.S.Lo..ConclusionAn effective technique is provided to purify and separate the polysaccharides of Stephania in these experiments.Stephania is a kind of officinal herb.The study on alkaloid is sufficient,but it is void on the research of non-alkaloid compositions.This study is helpful to develop the officinal using of the Stephania.Key words：Stephania epigeae;Stephania yunnanensis;Polysaccharides;Glucan;Contents防己科千金藤属植物有较好的药用价值，国内外都有相关报道。该属植物约60种，我国有39种和1变种，20世纪60年代科学家对其有效成分产生了兴趣，大量研究工作表明该属植物含有丰富的生物碱成分，但对该属植物其他成分的研究还较少见报道，国内曾报道对千金藤属植物粉防己地上部分分离得到两个双黄酮化合物、β－谷甾醇和正三十五烷［1，2］，从其根部还分离到两种葡聚糖［3］。由于千金藤属植物的良好药用价值，对其非生物碱成分的组成和活性的研究可帮助我们更加深入的了解该属植物的药效和药理作用。地不容和云南地不容为防己科千金藤属下的两种药用植物。地不容Stephania epigeae H.So.Lo为云南著名的传统中草药，民间常以山乌龟、金不换、地胆、白地胆称之。其味苦、辛，性寒，有小毒，具有清热、解毒、镇静、止痛、理气等功能；民间用于治疗风湿骨痛，胃痛，毒蛇咬伤等。研究表明地不容含有轮环藤宁、千金藤素、箭毒碱和异紫堇定碱［4］等生物碱成分。云南地不容Stephania yunnanensis H.S.Lo的块根含有颅痛定（rotundine）和青藤碱（sinomenine），前者有镇静作用，后者有肌松作用［5］。我们采集地不容和云南地不容的块根，用苯酚硫酸法对其总多糖含量进行测定，同时采用铜试剂沉淀法对其具葡聚糖结构的多糖进行了含量测定。为该两种植物多糖的分离纯化及多糖成分的结构、活性研究提供一定依据。1材料与设备地不容和云南地不容药材购自云南永仁药材有限公司，经本实验室王治平鉴定为防己科千金藤属植物地不容Stephania epigeae H.So.Lo和云南地不容Stephania yunnanensis H.S.Lo的新鲜块根，切片干燥后备用；重蒸苯酚（北京鼎国生物技术发展中心），标准葡萄糖，其余试剂均为分析纯，实验用水为单蒸水。电子分析天平（瑞士Sartorius BP221S），核酸蛋白仪（美国Beckman DU600），台式冷冻离心机（德国universal 32R）。2方法与结果2.1标准溶液与标准曲线制备2.1.1标准葡萄糖溶液的配制精密称取干燥至恒重的葡萄糖0.498 8 g，置50 ml量瓶中，加水溶解，定容，作为葡萄糖标准储备液（9.976 g/L）。取储备液1 ml，置100 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，配成浓度为99.76 mg/L的标准葡萄糖溶液备用。2.1.2 5％苯酚试剂的配制称取重蒸酚5.0 g，置100 ml棕色容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，放冰箱备用。2.1.3标准曲线制备精密量取99.76 mg/L的标准葡萄糖溶液0，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 ml分别置于具塞试管中，准确补水至2.0 ml，再分别加入5％苯酚溶液1.0 ml，在旋转混合器上混匀，小心加入浓硫酸10.0 ml,于旋转混合器上混匀，置沸水浴中煮沸2 min，冷却后在485 nm波长处测定其最大光吸收值，同时以水做空白，以吸光度为纵坐标，糖浓度为横坐标，得标准曲线，经计算回归方程为A＝7.6094 C－0.0224，r＝0.9980（n=7），葡萄糖浓度在4.988～49.88 mg/L范围内与吸光度呈良好的线性关系。2.2苯酚硫酸法测定总多糖含量2.2.1样品溶液制备精密称取已经干燥好的药材粉末1 g，置圆底烧瓶中，加50 ml水，加热回流1 h，稍冷即过滤，滤液置50 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。精密量取上述溶液5 ml，置于80 ml离心管中，加无水乙醇20 ml，混匀5 min后，以3 000 r/min离心5 min，弃去上清液。残渣用水溶解并定容至10 ml，混匀，即得样品测定母液。取母液1 ml，置25 ml量瓶中，加水稀释至刻度，即得样品测定液。2.2.2样品含量测定精密吸取样品测定液2.0 ml加入具塞试管，照“2.1.3”项下自“加入5％苯酚溶液1.0 ml”起，依法测定吸光度，随行空白，计算。结果见表1。2.2.3回收率精密称取药材粉末0.5 g，共3份，分别精密加入标准葡萄糖溶液2 ml（63.05 g/L），按上述方法测定，计算回收率。地不容总多糖的平均回收率为95.81％，云南地不容总多糖的平均回收率为93.22％。2.3铜试剂沉淀法测定葡聚糖含量2.3.1试剂①氢氧化钠溶液（100 g/L）：称取100 g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1 L，加入无水硫酸钠至饱和，备用。②铜试剂储备液：称取3.0 g CuSO4·5H2O，30.0 g柠檬酸钠，加水溶解并稀释至1 L，混匀，备用。③铜试剂溶液：取铜试剂储备液50 ml，加水50 ml，混匀后加入固体无水硫酸钠12.5 g并使其溶解。临用新配。④洗涤剂：取水50 ml，加入10 ml铜试剂溶液、10 ml氢氧化钠溶液，混匀。⑤硫酸溶液（10％）：取10 ml硫酸加入到80 ml左右的水中，混匀，冷却后稀释至100 ml。2.3.2样品溶液制备精密称取已经干燥的药材粉末1 g，置圆底烧瓶中，加50 ml水，加热回流1 h，稍冷即过滤，滤液置50 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。精密量取上述溶液5 ml，置于80 ml离心管中，加无水乙醇20 ml，混匀5 min后，以3 000 r/min离心5 min，弃去上清液。残渣用水溶解并定容至10 ml，混匀，取该溶液2 ml，置于离心管中，加入100 g/L氢氧化钠溶液2.0 ml，铜试剂2.0 ml，沸水浴中煮沸2 min，冷却，以3000 r/min离心5 min，弃去上清液。残渣用洗涤液数毫升洗涤，离心后弃去上清液，残渣用10％硫酸溶液2.0 ml溶解并转移至10 ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，即得样品测定液。2.3.3样品含量测定精密吸取样品测定液2.0 ml加入具塞试管，照“2.1.3”项下自“加入5％苯酚溶液1.0 ml”起，依法测定吸光度，随行空白，计算。结果见表1。表1地不容和云南地不容中总多糖和葡聚糖含量测定结果（略）2.3.4回收率精密称取药材粉末0.5 g，共3份，分别精密加入标准葡萄糖溶液1 ml（63.05 g/L），按上述方法测定，计算回收率。地不容葡聚糖的平均回收率为90.6％，云南地不容葡聚糖的平均回收率为92.74％。上述实验结果表明，采用苯酚硫酸法测定两种药材中的总多糖含量以及采用铜试剂沉淀法测定药材中的葡聚糖含量是稳定可行的。3讨论苯酚硫酸法是最常用的测定粗多糖含量的一种方法，其测定值可反映样品中粗多糖的总含量。由于地不容和云南地不容采用的是块根作为药用部分，因此用苯酚硫酸法测定的总多糖含量中存在淀粉等物质的干扰。使用铜试剂沉淀法，可排除淀粉类物质对测定的干扰，将具有葡聚糖结构的多糖沉淀下来，测定药材中葡聚糖的含量。董群等［3］从千金藤属植物汉防己根的热水提取液中分离出2个葡聚糖，通过免疫药理试验发现其具有一定的免疫促进作用。实验结果表明其同属植物地不容和云南地不容的根块茎中也含有一定量的葡聚糖，其活性如何，需要对地不容和云南地不容的多糖成分进一步分离纯化后进行活性筛选。对地不容和云南地不容的生物碱成分研究目前已经比较透彻，但对其非生物碱成分研究几乎处于空白状态，由于该类植物的药用价值较高，对其非生物碱化学成分的全面、深入的研究将进一步提高它们的药用价值。【参考文献】［1］马养民.千金藤属植物化学成分研究［J］.西北林学院学报,2004,19(3)：125.［2］Si D,Zhong D,Sha Y,et al,Biflavonoids from the aerial part of Stephania tetrandra［J］.Phytochemistry,2001,58:563.［3］董群,张志毅,林颖,等.汉防己多糖的研究［J］.生物化学与生物物理学报,1995,27(3):261.［4］邓业成,徐汉虹.广西地不容块根生物碱成分研究［J］.广西师范大学学报(自然科学版),2004,22(4)：73.［5］中国科学院昆明植物研究所.云南植物志，第3卷［M］.北京：科学出版社,1983:250.