小鼠孵化囊胚和猪囊胚玻璃化冷冻保存技术的研究畜牧业论文.doc

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小鼠孵化囊胚和猪囊胚玻璃化冷冻保存技术的研究_畜牧业论文【中文摘要】本论文对小鼠孵化囊胚和猪囊胚玻璃化冷冻保存技术体系进行了研究。实验内容包括：1)抗冻保护剂对小鼠孵化囊胚毒性试验；2)小鼠孵化囊胚玻璃化冷冻保存技术的研究。3)猪卵母细胞毒性试验及囊胚冷冻保存的研究。旨在为提高猪胚胎的冷冻保存效率摸索条件。小鼠孵化囊胚毒性试验结果，经mPBS、30％Ficoll和0.5mol/L sucrose液处理后，孵化囊胚恢复率均为100％，表明这些物质对胚胎不具有毒性作用。胚胎在25℃条件下的10％EG(v／v)或10％E+10％D溶液中平衡5min以内、EFS或EDFS冷冻液中平衡0.5min以内；37℃条件下的10％EG或10％E+10％D溶液中平衡2min以内、EFS或EDFS冷冻液中平衡0.5min以内，孵化囊胚恢复率与对照组(100％)均不存在显著差异(P＞0.05)。说明此种特定条件下进行冷冻前处理是较适合的。并证明玻璃化溶液的毒性主要来自乙二醇(EG)和二甲基亚砜(DMSO)，且随浓度升高、平衡时间延长以及处理温度升高，毒性增大。对小鼠孵化囊胚细管法、OPS法冷冻和解冻方法进行了比较研究。最佳冷冻组孵化囊胚恢复率结果表明，细管二步法(25℃)冷冻小鼠孵化囊胚，解冻后恢复率最高为87.0％，优于细管一步法(74.4％)；但与对照组(100％)存在显著差异(P＜0.05)。OPS法冷冻效果明显好于细管法。37℃条件下，OPS法冷冻后孵化囊胚恢复率高达97.8％，与对照组(100％)差异不显著(P＞0.05)。EDFS冷冻组胚胎解冻后采用方法C(0.3mol／L sucrose中平衡5min→0.15 mol／L sucrose中平衡2min)脱出抗冻保护剂最有效，用EDFS30和EDFS40细管法冷冻的孵化囊胚恢复率分别为87.0％和83.7％；而OPS法分别为97.8％和93.3％，均明显优于方法A(0.5mol／L sucrose中平衡5min)和方法B(0.5mol／L sucrose中平衡2min→0.3mol／L sucrose中平衡5min)。对EFS冷冻保存的胚胎，抗冻保护剂脱出方法间无差异。利用25℃室温下细管法和37℃条件下OPS法最佳冷冻组获得的133枚和154枚胚胎，分别移植给12只和10只假妊娠3～4d的受体母鼠。结果均有6只妊娠，分别产22只和36只仔鼠，产仔率分别为35.5％和39.1％，与对照组39.8％(37／93)差异均不显著(P＞0.05)。在37℃条件下，对猪体外成熟卵母细胞毒性试验的结果表明，猪卵母细胞在mPBS、30％Ficoll和0.5mol／L sucrose溶液中平衡20min后，经激活卵裂率和囊胚率分别为51.4％、48.0％、51.8％和20.6％、18.2％、18.8％，与对照组(54.5％和22.8％)差异不显著(P＞0.05)。在10％EG和10％E+10％D中处理2min以内，EFS和EDFS溶液中处理30s，对卵母细胞激活后的发育能力均不会产生影响(P＞0.05)。而其他处理组与对照组差异极显著(P＜0.01)。对149枚猪孤雌激活囊胚进行OPS法冷冻保存。其中在10％E+10％D中平衡30s，然后移入EDFS30中平衡25s冷冻。解冻后形态正常率达26.1％(18／69)，但均未继续发育。说明该方法有待进一步改进和提高。