口腔癌患者外周血树突状细胞的生物学特性_医学论文作者：张素欣，王士杰，单保恩，段玉芹，许艳枝【关键词】口腔肿瘤;树突状细胞;表型；增殖Biological characteristics of monocytederived dendritic cells from peripheral blood of patients with oral carcinoma【Abstract】AIM:To investigate the morphology,phenotype and functions of dendritic cell(DC)from peripheral blood of the healthy individuals and the patients with oral carcinoma.METHODS:Fifteen patients with oral carcinoma at stages of II or above were assigned to study group and 15 healthy volunteers to control group.Monocytes were isolated by density centrifugation,and cultured in the presence of GMCSF,IL4 and TNFαfor 7 d in vitro.The morphological change of the cultured cells was observed by light microscopy and electron microscopy.The expressions of CD83,CD1a,CD86,CD80,HLADR were analyzed by flow cytometry.The ability of DC to stimulate the proliferation of lymphocyte in mixed lymphocyte reactions(MLR)was determined with the method of MTT.RESULTS:Morphologically and phenotypically typical DC was obtained in the 2 groups after culture for 7 d.The expression rates of CD83,CD1a on DC from the patients were 49.3±9.5 and 48.1±7.3 respectively，significantly lower than those from healthy volunteers(P<0.05).The DC from the patients had the lower expression levels of CD86,CD80 and HLADR(85.5±8.7,83.2±8.1 and 78.3±5.4)than healthy volunteers did(89.2±6.7,87.7±7.2 and 82.3±4.1),but not significantly(P>0.05).Moreover,the mean fluorescence intensity of CD83,CD1a,CD80,CD86 and HLADR expressed in study group were 4.80±2.13,3.96±1.15,19.63±8.12,12.33±6.75 and 39.44±7.9,respectively,which were lower but not statistically different from the control group(P>0.05).In addition,DC from the study group had the ability to stimulate the proliferation of allogeneic and autogenous lymphocytes in vitro.CONCLUSION:Monocytes in peripheral blood of the patients with oral carcinoma can be induced to differentiate into mature DC with the ability to stimulate the proliferation of lymphocytes,and so these DC might be used in immunotherapy for oral carcinoma.【Keywords】mouth neoplasms;dendritic cell;phenotyping;proliferation【摘要】目的:研究口腔癌患者外周血树突状细胞(DC)的形态、表型和功能性变化及其临床意义.方法：口腔癌患者（实验组）及正常人（对照组）15例外周血单个核细胞经GMCSF,IL4及TNFα诱导培养,获取成熟DC,光镜和电镜观察细胞的形态，流式细胞仪检测细胞表型如CD1a,CD83,CD80,CD86和HLADR等分子的表达变化，用噻唑蓝（MTT）法检测DC与自体和同种异体的混合淋巴细胞反应（MLR）中对淋巴细胞增殖的刺激能力.结果：正常人及口腔癌患者的外周血单个核细胞经体外7 d诱导培养，均诱导出具有典型形态和表型的DC,其中实验组细胞的CD83，CD1a表达率分别为49.3±9.5和48.1±7.3，与对照组两者表达率62.1±7.9和60.2±6.8相比,差异有统计学意义(P<0.05),CD86，CD80和HLADR的表达率分别为85.5±8.7，83.2±8.1和78.3±5.4，与对照组三者表达率89.2±6.7，87.7±7.2和82.3±4.1相比无明显统计学差异(P>0.05);实验组DC细胞CD83，CD1a，CD86，CD80和HLADR表达的平均荧光指数(MFI)分别为4.80±2.13，3.96±1.15，12.33±6.75，19.63±8.12和39.44±7.9，均低于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05);口腔癌患者来源的DC在体外具有诱导同种异体和自体外周血T细胞增殖的能力.结论：口腔癌患者外周血单核细胞来源可诱导成为具有功能性的成熟DC，该细胞可应用于口腔癌的免疫治疗.【关键词】口腔肿瘤;树突状细胞;表型；增殖0引言目前，对口腔癌的治疗手段仍以手术为主，由于颌面部能提供的切除面积有限，有时很难实现距肿瘤边缘1.5 cm清除病灶，而且手术本身造成的面部畸形严重破坏了患者的口腔功能和心理健康.因此，如何缩小手术范围、有效控制临近亚病灶及微小病灶的发展是亟待解决的问题.树突状细胞（dendritic cells,DC）是已知功能最强的抗原提呈细胞，并被认为是抗肿瘤免疫治疗的一种非常有前途的方法［1-3］，由于DC对T细胞的活化受MHC限制，故临床应用的DC细胞及其疫苗必须使用肿瘤患者自身来源的DC，那么从肿瘤患者的外周血单个核细胞中能否经过体外诱导产生出功能性DC，口腔癌患者与健康人DC细胞的表型及其抗原提呈分子的表达以及刺激淋巴细胞增殖能力有何不同，因此本研究旨在为临床以DC为基础的免疫治疗提供实验依据.1材料和方法1.1材料RPMI培养基(Hyclone USA),淋巴细胞分离液(上海恒生公司),重组人单核巨噬细胞集落刺激因子(rhGMCSF),重组人白细胞介素4(rhIL4),肿瘤坏死因子α(TNFα)均使用美国Peprotech Asia公司产品.取200505/200510来我院口腔科住院治疗的口腔癌患者15例作为实验组，本组病例均经术后病理证实；对照组为健康志愿者15例.两组人员均排除感染、糖尿病、血液病和自身免疫性疾病.1.2方法无菌采集外周血50 mL，肝素钠抗凝.加入等量无钙镁DHanks缓冲液（pH 7.4），充分混匀.取50 mL离心管加入Ficoll淋巴细胞分离液20 mL后，再沿壁小心加入上述稀释的外周血20 mL，2000 r/min，20 min离心，分离外周血单个核细胞.小心吸取中间层细胞，用DHanks洗涤细胞3次，弃上清，用含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞浓度为1×1010个/L，接种于6孔培养板，每孔3 mL.于50 mL/L CO2,37℃条件下孵育2～3 h后，吸出培养上清和非贴壁细胞（用于其他实验），用预热37℃的培养基清洗板1次，以去除非贴壁细胞，获得贴壁的单核细胞，加入含1 MU/L rhGMCSF和0.5 MU/L rhIL4的RPMI 1640完全培养基于37℃50 mL/L CO2进行培养，孵育至第5日时，每孔加入TNFα0.2 MU/L,7 d后得到成熟的DC［4］.诱导培养1，3，5，7 d时用倒置显微镜观察细胞的形态变化及DC形成，在培养的7 d收集DC，调细胞密度为1×107/L，分为两份，一份用10 g/L戊二醛固定30 min,梯度乙醇脱水，叔丁醇干燥，喷金，扫描电镜观察细胞形态.另一份用25 g/L戊二醛固定，锇酸后固定，醋酸钠、柠檬酸铅双重染色，透射电镜观察细胞超微结构.1.2.1FACS测定细胞表型收集体外培养5，7和10 d的外周血单个核细胞，台盼蓝染色，确定细胞活力在95%以上，分别加入直标荧光的，如PE标记的CD1a,CD86,HLADR,IgG1（对照），FITC标记的CD83,CD80,IgG2（对照），充分均匀染色(4℃,避光,30 min)后FACS行细胞表型检测.1.2.2混合淋巴细胞反应非贴壁细胞调整密度为2×109/L，加入96孔培养板中，分别按10∶1,20∶1和40∶1的比例加入上述培养的两组DC（保持T细胞数为105），该DC先用25 mg/L丝裂霉素于37℃孵育45 min，然后调整细胞密度为2×108/L，加入培养板各孔内，总体积200μL/孔，各实验组分设3复孔，混匀，同时设对照组.37℃，50 mL/L CO2培养72 h.于实验培养终止前4 h，加入MTT液（5 g/L）20μL/孔，混匀，继续培养4 h，离心培养板（1000 r/min,5 min），弃上清，每孔加入DMSO（二甲基亚砜）150μL，充分混匀，静置数分钟，检测每孔490 nm的A值，计算细胞培养指数［5］.增殖指数（SI）=试验孔A均值/对照孔A均值.统计学处理：采用SPSS11.0软件包进行统计分析;两组样本均数的比较用t检验，多样本均数比较用方差分析,P<0.05为差异有统计学意义.2结果2.1培养DC的形态学特点人外周血贴壁细胞经体外诱导培养24 h后，细胞聚集成大小不等的细胞聚体，3 d可见细胞聚集成团,少量悬浮生长，部分细胞体积增大.5 d悬浮细胞数量增多,细胞表面有细小突起形成.7 d悬浮细胞或细胞团颜色变深，有明显树突状突起，扫描电镜观察,表面粗糙,胞体向周围伸出大量树枝状或裙褶状不规则突起.透射电镜观察,细胞表面伸出长短不一的突起,线粒体致密化，粗面内质网扩张成池状，溶酶体较少（图1），呈明显的DC细胞特征.图1人外周血单个核细胞经体外诱导培养7 d DC形态TEM×10 000略2.2体外诱导DC细胞的表型变化人外周血单个核细胞经体外诱导培养7 d后，实验组（口腔癌患者）DC细胞的CD83和CD1a的表达率较对照组低,差异有统计学意义(P<0.05),但CD86,CD80和HLADR的表达率两组差异无统计学意义(P>0.05);实验组DC细胞的CD83,CD1a,CD86,CD80和HLADR表达的平均荧光指数(MFI)虽然均低于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05,表1）.表1口腔癌患者外周血DC表面分子的表达比较（略）2.3DC对淋巴细胞增殖反应的影响在自体和同种异体淋巴细胞反应体系中，随着DC比例增加，实验组和对照组淋巴细胞增殖能力均明显增强，实验组自体AMLR增殖均值由1.8升至3.2，健康人自体AMLR增殖均值由2.2升至4.1，差异有统计学意义（P<0.05）.实验组DC与健康人DC在同种细胞比例下，对淋巴细胞的促增殖能力无统计学差异（图2）.图2DC对T细胞增殖的影响略3讨论近年来，对实体瘤的免疫生物治疗称为肿瘤防治的研究热点，免疫防御机制用于头颈部癌的治疗已显示较好疗效［6］，而DC作为体内功能最强的专职性抗原递呈细胞（APC）,能刺激未致敏T细胞的增殖和活化、启动机体的特异性免疫应答，在肿瘤免疫治疗中发挥着重要作用.人体内DC大多处于不成熟状态，激活淋巴细胞反应的能力较低，但具有极强的抗原内吞能力.在摄取抗原或接受某些刺激因素后DC可以分化成熟，由于体内DC数量少而且分布广泛，难以分离纯化，怎样通过简单有效的方法制备出大量的功能性DC来满足临床需要，是亟待解决的问题.目前，体外培养的DC主要来源于外周血、骨髓和脐血.我们应用口腔癌患者和健康人外周血单个核细胞诱导DC的产生.因为外周血采集方法简单易行，容易获取，而且与骨髓相比不易污染肿瘤细胞.研究表明，在决定DC是否可以发育成熟的调控因素中，GMCSF，IL4和TNFα是极其重要的诱导因子，其中GMCSF可促进髓系细胞发育，是维持DC发育和分化的最根本的细胞因子；IL4可促进干细胞及单核细胞分化发育成DC，并维持DC于未成熟状态，使其具有很强的处理外源性抗原的能力［7］.在DC培养过程中加入TNFα可以促进DC成熟，使其具有强的刺激T细胞的活性，并抑制DC凋亡［8-9］.我们对口腔癌患者及健康人外周血单个核细胞经GMCSF，IL4和TNFα3种细胞因子体外诱导分化，获得具有典型DC细胞形态特征的DC.经诱导培养至第7日时两组DC均高表达CD86，CD80，HLADR，差异无显著性，与文献［10］报道一致.而两组DC之间CD83和CD1a的表达率有明显差异.CD83是目前公认的成熟DC标志分子，我们考虑该差异源于两组PBMC的贴壁率和DC转换率不同.Onishi等［11］认为晚期肿瘤患者的单个核细胞来源的DC中存在一种叫短寿命的亚群，培养超过7 d，较短命的亚群死亡，幸存的DC无论是表面分子表达、MLR和抗原提呈能力均与健康人相似.本实验结果显示，患者单个核细胞来源的DC在体外同样具有激发自体和同种异体外周血T细胞增殖的作用，并且随着DC数量的增加对淋巴细胞增殖能力刺激作用增强.我们认为，口腔癌患者来源的MoDC在初始状态可能与健康人有一定的免疫学差异，但是通过合理的因子组合培养后，同样能发挥针对自身疾病的免疫治疗作用，从而避免使用他人血源的排斥反应，怎样针对患者自身来源的DC特性选择更合适的培养手段，发挥它的特异性免疫治疗效果，尚需进一步研究.【参考文献】［1］Ponsaerts P，Van Tendeloo VFI，Berneman ZN,et al.Cancer immunotherapy using RNAloaded dendritic cells［J］.Clin Exp Immunol,2003,134:378-384.［2］Griffioen M,Borghi M,Schrier P,et al.Analysis of Tcell responses in metastatic melanoma patients vaccinated with dendritic cells pulsed with tumor lysates［J］.Cancer Immunol Immunother,2004,53:715-722.［3］Holtl L,ZelleRieser C,Gander H,et al.Immunotherapy of metastatic renal cell carcinoma with tumor lysatepulsed autologous dendritic cells［J］.Clin Cancer Res,2002,8:3369-3376.［4］Grunebach F,Muller MR,Nencioni A,et al.Delivery of tumorderived RNA for the induction of cytotoxic Tlymphocytes［J］.Gene Ther,2003,10:367-374.［5］Westermann J,Korner J,Kopp J,et al.Cryopreservation of mature 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