冠心病并高同型半胱氨酸血症患者甲硫氨酸合成酶基因突变的研究临床医学论文.doc

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冠心病并高同型半胱氨酸血症患者甲硫氨酸合成酶基因突变的研究_临床医学论文【摘要】目的:研究中国人冠心病并高同型半胱氨酸血症患者甲硫氨酸合成酶（MS）基因突变的情况。方法:应用聚合酶链反应单链构象多态性分析(PCRSSCP)以及DNA测序技术,检测60例患者MS基因中与结构和功能密切相关的10个外显子的点突变情况。结果:除已知的31外显子区3个SNP位点比较常见外,还发现了1个新的点突变,3869位为A/G杂合子（A→G的错义突变可使1195位氨基酸由异亮氨酸变为缬氨酸）,此患者的血浆同型半胱氨酸血水平明显高于正常,为30.93μmol·L-1。此外发现32内含子1个新的G/T多态性。结论：MS某种基因突变可能是影响MS酶功能及高同型半胱氨酸血症的原因之一。【关键词】高同型半胱氨酸血症冠心病甲硫氨酸合成酶基因突变甲硫氨酸合成酶（MS或MTR）是同型半胱氨酸代谢途径中的关键酶之一,可催化同型半胱氨酸再甲基化合成甲硫氨酸。高同型半胱氨酸血症与冠心病的发生发展可能有一定关系。为了研究中国人冠心病并高同型半胱氨酸血症患者MS基因突变的情况,我们应用聚合酶链反应单链构象多态性分析(PCRSSCP)以及DNA测序技术,检测了60例冠心病并高同型半胱氨酸血症患者MS基因中10个与结构和功能密切相关的外显子的点突变。1对象和方法1.1研究对象选取我院住院的冠心病患者（根据临床表现、心电图或冠状动脉造影诊断）中空腹血浆同型半胱氨酸水平高于15μmol·L-1者60例,实验发现新突变后再选取同型半胱氨酸水平正常者19例作为对照。1.2实验方法1.2.1基因组DNA的提取采集外周静脉血,传统酚氯仿法提取基因组DNA。1.2.2 PCR反应PCR扩增MS基因第18、19、20、21、22、23、29、30、31、32外显子,引物序列和扩增片段见表1,反应体系包括引物、MgCl2、dNTP、Taq酶、基因组DNA。1.2.3 SSCP及测序分析取PCR反应产物10μl,95℃变性10 min,冰上骤冷,立即上样于6%～8%非变性聚丙烯酰胺凝胶,垂直电泳仪电泳6～10 h后凝胶银染,观察迁移带型。电泳显示异常带型的PCR反应产物,经纯化后进行测序分析,测序由北京三博远志生物技术有限公司完成。2结果60例冠心病并高同型半胱氨酸血症患者的MS基因10个外显子中,31外显子的PCR扩增片段显示出异常带型,分别进行测序,结果显示有3个已知的SNP位点,包括3778C/A、3782C/T、3862C/T,均为同义突变,此外发现了1个新的点突变,1例患者在31外显子区3869位为A/G杂合子（测序图见图1，以上位置为mRNA位置）,A→G的错义突变可使1 195位氨基酸由异亮氨酸变为缬氨酸,此患者的血浆同型半胱氨酸血水平为30.93μmol·L-1,明显高于正常,而在同型半胱氨酸水平正常者中未显示出同样的异常带型,测序也未发现此种突变,并且此例患者其它相关酶亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)、胱硫醚缩合酶(CBS)也未检测出有意义的突变。32外显子的PCR扩增片段显示出1种异常带型,经测序分析发现为内含子G/T多态性,经核查为一个新的SNP位点,但对编码蛋白质没有影响,同型半胱氨酸水平正常者中也有此多态性。表1 MS基因中10个外显子的PCR引物序列及扩增片段长度3讨论研究发现高同型半胱氨酸血症与心脑血管疾病及某些先天畸形有一定关系。同型半胱氨酸是甲硫氨酸的中间代谢产物,其代谢有转巯基涉及胱硫醚缩合反应和再甲基化生成甲硫氨酸两种途径,前者需CBS催化,后者需MS催化,且在提供甲基的过程中需MTHFR的参与。高同型半胱氨酸血症是由于遗传和环境营养因素多方面造成的,同型半胱氨酸代谢途径中的关键酶基因突变是其发生的重要遗传因素之一，MS就是其中之一。MS cDNA于1996年克隆[1],此后研究发现MS基因编码区域有33个外显子和32个内含子,其中19至25外显子区与其编码的蛋白质β片状二级结构有关,并且为维生素B12即钴胺素辅基结合区域,26至33外显子区为编码的蛋白质活性区域,不同图1 31外显子的测序图的突变可能会对MS酶造成不同的影响[2]。研究较多的突变位点在P1173L、D919G,国内戴崇文等[3]研究未发现A2756G（D919G）与中国人心脑血管病的关系,但有研究发现此多态性与先天畸形发病如先天性心脏病有一定关系[4]。我们选取了18、19、20、21、22、23、29、30、31、32外显子区,应用PCRSSCP及DNA测序技术,对60例中冠心病并高同型半胱氨酸血症患者进行研究,结果除发现已知的31外显子区3个SNP位点（无义突变）外,还发现了1个新的点突变,3869位(mRNA位置)为A/G杂合子,发生了A→G的错义突变（I1195V）,此患者血浆同型半胱氨酸水平明显升高,而同型半胱氨酸水平正常者中未发现此种点突变,说明这是一个错义突变,并且此例患者其它相关酶MTHFR、CBS未检测出有意义的突变,因此发现的新突变与Hcy水平升高可能有关。本研究中没有检测出国外报道中常见的P1173L突变,检测到的已知的3个位点均为无义突变,没有临床意义，另外在32内含子发现了1个G/T多态性，因此MS基因变异在国内外人群可能有种族差异。本研究中新发现的错义突变可能与影响MS酶功能及高同型半胱氨酸血症的发生有关,但在人群中突变率如何及其临床意义尚有待大样本进一步研究。【参考文献】[1]LECLERC D,CAMPEAU E,GOYETTE P,et al.Human methionine synthase:cDNA cloing and identification of mutations in patients of the cb1G complementation group of folate/cobalamin disorders[J].Hum Mol Genetics,1996,5(12):18671874.[2]WATLINS D,RU M,HWANG H Y,et al.Hyperhomocysteinemia due to methionine synthase deficiency,cb1G:structure of the MTR gene,genotype diversity,and recognition of a common mutation,P1173L[J].Am J Hum Genet,2002,71(1):143153.[3]戴崇文，张广森.缺血性心、脑血管疾病患者同型半胱氨酸代谢相关酶基因突变频度的研究[J].中华血液学杂志,2001,22(9),484487.[4]ZHU W L,CHENG J,DAO J J,et al.Polymorphism of methionine synthase gene in nuclear families of congenital heart disease[J].Biomed Environ Sci,2004,17(1):5764.