关于鸡蛋蛋清和蛋白多酶水解工艺的优化.doc

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关于鸡蛋蛋清和蛋白多酶水解工艺的优化=“news_bd”>鸡蛋蛋清、蛋白中蛋白质含量高达13%~15%，富含多种对人体有益的蛋白质。鸡蛋蛋清、蛋白所含人体必需氨基酸的种类多，配比平衡性好，是生物利用效率最高的一类蛋白质。鸡蛋蛋清、蛋白质的黏度大，热稳定性差，且含有卵类黏蛋白、卵白蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶等过敏性蛋白，其应用范围因此而受到限制。水解可以降低蛋清、蛋白的相对分子质量，减小致敏性，生成的多肽混合物更有利于人体吸收，与原蛋白相比，其水解产物的黏度、溶解性及起泡性等功能特性得到了改善，且具有抗氧化、降血脂、降血压等生理活性。单酶水解鸡蛋蛋清、蛋白存在水解度不高、蛋白残留量高、蛋清肽得率低和易产生苦味肽等缺点，因而，研究者尝试用多酶水解来解决上述问题。由于单一蛋白酶水解蛋白质具有专一性，所以，蛋白酶的单一使用使底物中相应的肽键断裂，联合使用则因为酶作用位点之间产生互补而降低蛋白残留量，提高水解度，增加蛋清、蛋白肽得率。笔者研究protamex、neutrase、flavourzyme组合和alcalase、flavourzyme组合水解蛋清、蛋白的水解物的性能，将能降低水解液苦味的端肽酶Flavourzyme作为水解蛋清、蛋白最终加入的酶，以优化多酶同时水解及分阶段水解的参数，旨在为蛋清、蛋白多酶水解工艺的优化提供参考依据。1材料与方法1.1材料鸡蛋为市售鲜鸡蛋。商业酶protamex、neutrase 0.8 L、alcalase 2.4 LFG和flavourzyme 500MG购自诺维信公司。所用试剂为浓硫酸、硫酸铜、无水硫酸钾、氢氧化钠、硼酸、盐酸、甲基红–溴甲酚绿指示剂、甲醛、30%过氧化氢等。1.2主要仪器与试剂主要仪器：HS–4(B)型恒温浴槽(成都仪器厂)、722可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)、KDN–04B消化炉(上海新嘉电子有限公司)、KDN–04B定氮仪(上海新嘉电子有限公司)、SHA–C水浴恒温振荡器(常州国华电器有限公司)、5810R离心机(德国艾本德(Eppendorf)股份公司)、79–2磁力加热搅拌器(常州国华电器有限公司)、PB–21 pH计(德国Sartorius赛多利斯)、Waters 600高效液相色谱仪(配备2487紫外检测器、Empower工作站，美国Waters公司)、Ag1100安捷伦液相色谱仪(美国安捷伦公司)。1.3方法1.3.1水解前处理将新鲜鸡蛋洗净，用75%的乙醇棉球擦拭蛋壳，使用漏勺分离蛋清、蛋黄，用灭菌蒸馏水将蛋清稀释至一定浓度(浓度以V蛋清∶V水表示)，95℃加热变性20 min，用HCl或NaOH调节至一定pH供水解。1.3.2水解在反应温度条件下水浴预热后，加入所需酶，于恒温水浴振荡器(120 r/min)中进行水解反应。水解反应期间用pH计监测蛋清液的pH，并通过滴加NaOH溶液来调节pH，使pH保持在一定值。于设置的水解时间收集蛋清、蛋白水解液，置沸水浴中灭活酶20 min，使水解反应终止。水解方式分为2种：1)将最适温度和pH相近的蛋白酶(protamex、neutrase、flavourzyme 3种酶，下文用P+N+F表示)同时加入进行水解，水解温度设定为55℃，酶总量设定为6%，针对水解时间、pH、酶比例和蛋清浓度4个因素进行正交设计。2)对于最适温度和pH相差较大的蛋白酶alcalase和flavourzym(下文用A–F表示)，在alcalase的最适温度(55℃)和最适pH(7.5)条件下反应一定时间后，将反应底物溶液调至flavourzyme的最适温度(55℃)和最适pH(6.0)，再加入flavourzym进行水解。alcalase、flavourzyme分阶段水解蛋清、蛋白的酶总用量设定为6%，针对蛋清浓度、酶比例和水解时间3个因素进行正交试验。1.3.3测定指标及方法1)水解度的测定。总氮含量测定采用凯氏定氮法，由凯式半自动定氮仪测得。氨基氮含量测定由甲醛滴定法测得。水解度=氨基氮含量/总氮含量。蛋白残留率=离心沉淀物的含氮量/总氮含量。2)蛋清、蛋白水解物相对分子质量的测定。将蛋清、蛋白水解物溶液经0.45μm微孔过滤膜过滤后上TSK gel 2000色谱柱，以细胞色素C(MW12500)、抑肽酶(MW6500)、杆菌酶(MW1450)、乙氨酸–乙氨酸–酪氨酸–精氨酸(MW451)和乙氨酸–乙氨酸–乙氨酸(MW189)为标准品，测定水解物的相对分子质量。高效液相色谱条件：色谱柱TSK gel 2000，7.8mm×300 mm;柱温30℃;流速0.5 mL/min;检测波长220 nm;流动相乙腈、水、三氟乙酸的体积比为45.00∶55.00∶0.01。3)氨基酸组成分析。总氨基酸组成分析：将蛋清、蛋白水解液样品溶解在6 mol/L盐酸中，110℃水解24 h，蒸干盐酸，定容得水解液。用Agilen 1100高效液相分析仪测定水解液中的氨基酸组成。高效液相色谱条件：C18柱，4.0 mm×125 mm;柱温40℃;流速1.0 mL/min;检测波长338 nm和262 nm(Pro);流动相A为20 mmol/L的醋酸钠液，流动相B为20 mmol/L的醋酸钠液和甲醇及乙腈，其体积比为1∶2∶2。游离氨基酸组成分析：将蛋清、蛋白水解液样品与10%三氯乙酸溶液等体积混合，在室温下静置2h，经双层滤纸过滤后，取1 mL于1.0×104g离心10min。用在线自动衍生化用Agilent 1100高效液相分析仪测定水解液(上清液)中氨基酸组成。2结果与分析2.1 P+N+F水解鸡蛋蛋清、蛋白的试验结果2.1.1正交试验结果由表1中的极差分析结果可知，在55℃条件下，水解时间、pH、酶比例、蛋清浓度对水解反应的影响依次减小。3种酶同时水解鸡蛋蛋清、蛋白的最优组合为A2B2C2D3，即水解时间为6 h、pH为6.5、酶比例为1∶1∶2、蛋清浓度为1∶5。在此条件下的水解度达53.24%。2.2 A–F水解鸡蛋蛋清、蛋白的试验结果2.2.1正交试验结果影响水解反应的主次因素依次为酶比例、蛋清浓度、水解时间，最优组合为A3B1C2，即蛋清浓度1∶5，酶比例为1∶2，水解时间各为3 h。在此条件下的水解度可达45.05%。3结论与讨论蛋白水解物的苦味主要来自于水解物中的疏水性多肽。如果用于水解的蛋白酶是非专一性的内切酶，那么它们对蛋白原料的酶切作用是随机的，无论采用何种水解条件都会或多或少产生游离氨基酸，且随着水解度的提高，蛋白质内部的疏水性氨基酸末端大量游离出来，小肽末端的疏水性氨基酸残基也逐渐暴露，水解产物的苦味越重。呈苦味的氨基酸主要有亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、色氨酸、精氨酸、苯丙氨酸。这些疏水性氨基酸残基在水解液中的比例越高，苦味可能越大。苦肽也是蛋清、蛋白水解物产生苦味的原因之一。控制或消除蛋白水解液苦味的方法包括选择性分离法、掩盖法、类蛋白反应和酶法处理。酶法水解过程易于控制，效率高，且条件温和，不会使多肽的营养成分丢失，不改变多肽的重要特性。肽链端解酶(端肽酶)是酶法处理中主要的酶类。肽链内切酶是酶法处理中的另一种酶类，从肽链的内部将肽链裂开。flavourzyme兼具内外肽酶的活性，将其用于水解不仅能产生端肽酶的外切效应，还能产生美拉德反应，生成浓香的风味物质，使水解液的苦味大大降低。将flavourzyme和其他蛋白酶联合水解不仅能促进蛋白质的溶出，提高氮的回收率，而且可有效水解苦味肽，减轻甚至消除苦味，获得苦味值低、溶解性好的蛋白水解产物。吴晖等发现，蛋清水解专用蛋白酶与碱性蛋白酶alcalase AF 2.4 L、碱性蛋白酶alcalase AF 2.4 L与胰蛋白酶组合水解鸭蛋蛋清、蛋白的效果较好，在水解8 h后水解度可达26.2%和26.6%，明显优于其单酶的水解效果。万丽娜等发现flavourzyme修饰后的水解液苦味很小，接受度较高。毛善勇等以牛肉为原料，先用protamex在其优化条件下水解6 h，再用flavourzyme在其优化条件下水解6 h，所得产物的水解度达24.26%，比protamex单酶水解牛肉蛋白的水解度提高了11.69%。本试验中，protamex、neutrase、flavourzyme同时水解鸡蛋蛋清、蛋白的水解度达53.24%，比其单独水解的水解度分别提高了45.84%、49.53%和14.49%;alcalase、flavourzyme分阶段水解的水解度达45.05%，比其单独水解的水解度分别提高了26.32%和6.3%。多酶(分步)水解产物的水解度大幅度增高，主要是因为flavourzyme氨基肽酶的作用，可选择性从多肽和蛋白质N–端水解释放氨基酸，使水解液中氨基氮明显上升[14]。由于不同蛋白酶的作用位点不同，采用多酶复合水解可产生互补效应，能进一步提高水解度和肽的得率。笔者发现protamex和neutrase单酶水解的水解度低，neutrase单酶水解的蛋白残留率高，将二者同时与蛋清、蛋白作用能提高水解度，还能改善水解液的风味。alcalase是内切酶，用其水解鸡蛋蛋清、蛋白所得的水解液苦味值较大，在alcalase水解一段时间后添加flavourzyme可使苦味值大大降低。Cigic等[12]发现alcalase和flavourzyme分阶段水解有效降低了鸡蛋清水解液的苦味，并提高了水解度。本试验中，protamex、neutrase、flavourzyme同时水解鸡蛋蛋清、蛋白产物的相对分子质量分布主要集中在500以下，其中相对分子质量>180~300和>300~500所占比例分别为68.06%和18.65%。alcalase、flavourzyme分阶段水解鸡蛋蛋清、蛋白产物的相对分子质量主要分布在1 000以下，其中>180~300和>300~500所占的比例分别为67.65%、16.05%。可以看出，多酶水解蛋清、蛋白产物主要以短肽形式存在。短肽有利于人体吸收，致敏性更低，还可提供抗氧化、降血压、抗菌、降血脂等生物活性，有扩大蛋清应用范围的潜力。protamex、neutrase、flavourzyme同时水解产物的总游离氨基酸含量为7.404 6 mg/mL，占总氨基酸含量的44.02%;alcalase、flavourzyme分阶段水解产物的总游离氨基酸含量为6.819 3 mg/mL，占总氨基酸含量的38.01%。可见，多酶水解产物总氨基酸中，游离氨基酸所占比例较大，在3种酶同时水解的条件下所占比例约达50%。杨万根等利用单酶alcalase 2.4 L碱性蛋白酶和protease N蛋白酶水解蛋清、蛋白，得到的总游离氨基酸含量分别为6.429、4.193 mg/mL。本试验中多酶水解产物的总游离氨基酸含量与此相比均有明显提高。另外，protamex、neutrase、flavourzyme 3种酶同时水解物总氨基酸中7种必需氨基酸的含量为43.56%，Alcalase、Flavourzyme分阶段水解物总氨基酸中7种必需氨基酸的含量为42.68%，均略高于酶解前蛋清、蛋白中7种必需氨基酸的含量(42.41%)。通过综合分析，由本试验结果可得到如下结论：1)protamex、neutrase和flavourzyme同时水解鸡蛋蛋清、蛋白的优化条件为水解时间为6 h、pH 6.5、酶比例为1∶1∶2、蛋清浓度为1∶5，在此条件下水解6 h的水解度达53.24%，产物中相对分子质量300以下的比例达68.06%，游离氨基酸比例达44.02%。2)alcalase和flavourzyme分阶段水解鸡蛋蛋清、蛋白的优化条件为蛋清浓度1∶5、酶比例为1∶2、水解时间各3 h，在此条件下的水解度达45.05%。产物相对分子质量大部分集中在500以下，≤180、>180~300和>300~500所占的比例分别为11.89%、67.65%、16.05%，游离氨基酸比例达38.01%。