激肽原基因KNG1(-1742TC,Ile581Thr)多态性与血浆高分子量激肽原特种医学论文.doc

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激肽原基因KNG1(-1742T>C,Ile581Thr)多态性与血浆高分子量激肽原_特种医学论文KNG1基因定位于第3号染色体包表达高分子量激肽原(HK)和低分子量激肽原(LK)。HK是120 kDa的单链糖蛋白，主要作用是接触性激活[1]。HK分为6个结构域，6区具有激肽释放酶原和凝血因子结合的位点，激肽释放酶使HK在Lys362~Arg363和Arg371~Ser372之间裂解[2]，释放出缓激肽，同时产生两条链的活化型高分子激肽原(HKa)。HKa包含一个62 kDa的重链和一个56 kDa的轻链，并通过1区Cys10和6区Cys604之间形成的二硫键相连接[3]。从HK转变成HKa的过程，伴随着显著的结构重排，HKa以重新组成的结构域为特征，并且增加了第5区的暴露面[4]，从而可以诱导增生的内皮细胞凋亡，抑制血管再生。高分子量激肽原第5结构域也可以阻碍黑素瘤细胞的新陈代谢，抑制血小板的粘附聚集，调节血小板与白细胞的相互作用。1资料与方法1.1一般资料病例组(LEDVT组)：2011年1-12月在福建省立医院住院的下肢深静脉血栓形成(LEDVT)患者共143例。纳入标准为：根据中国中西医结合学会周围血管疾病专业委员会制定的下肢深静脉血栓形成诊断标准进行诊断[5]，并全部经过下肢深静脉造影确诊。对照组：同期在福建省立医院门诊体检及住院的患者中无LEDVT病史者150例。两组研究对象均来自于福建本地的汉族人群，无血缘关系，非近期结婚。

1.2所有研究对象排除标准如下：(1)手术、创伤史、严重感染；(2)急性心梗、急性心衰、急性脑血管意外者；(3)心脑血管其他部位血栓，既往血栓病史；(4)恶性肿瘤、严重肝肾疾病、尿毒症、糖尿病者；(5)DIC、近期内服用激素、免疫抑制剂、抗凝药、抗血小板药。

1.3方法(1)采血：所有研究对象均常规禁食8 h后，于次日清晨6点至8点抽取肘静脉血4 ml，2 ml以乙二胺四乙酸(Ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝管收集，用于提取基因组DNA；2 ml以枸橼酸钠抗凝管收集，用于测定血浆高分子量激肽原浓度。(2)血浆高分子量激肽原浓度测定：人的高分子量激肽原(HMWK)酶联免疫吸附测定试剂盒测定。(3)细胞基因组DNA提取试剂盒：购自北京天根生化科技有限公司。(4)PCR反应：2×MasterMix 12.5μl、上游引物10uM 1μl、下游引物10uM 1μl、cDNA 2μl加DEPC水8.5μl组成25μl体系。(5)引物：委托大连宝生物工程有限公司合成。(6)PCR产物酶切：PCR产物10μl、10×FastDigest buffer 2.0μl、DraIII内切酶1.0μl加去离子水17μl组成20μl体系。

1.4统计学处理所有数据均用SPSS 13.0软件进行分析。计量资料以(x±s)表示，两组均数差异比较先行方差齐性检验(Levene Statistic)，方差齐采用t检验，方差不齐采用t’检验。研究对象与Hardy-Weinberg遗传平衡的符合程度采用四格表字2检验。基因型频率构成比采用秩和检验。

2结果2.1两组临床资料比较两组活化部分凝血活酶时间(APTT)、高分子量激肽原(HK)比较差异均有统计学意义(P<0.05)，LEDVT组的HK浓度高于对照组，APTT低于对照组。见表1、表2。

表1两组临床资料比较组别APTT HK病例组(n=143)33.5±7.5 7.86±2.31对照组(n=150)37.6±8.9 7.20±1.89P值0.036 0.003表2两组在KNG1不同基因型间APTT、血浆HK的比较组别1742CC+TC型1742TT型P值病例组(n=143)APTT 32.5±7.4 36.8±7.2 0.0014HK 7.86±2.23 7.02±2.08 0.0325对照组(n=150)APTT 34.8±7.3 37.8±7.6 0.0197HK 7.85±2.12 7.01±2.02 0.01722.2KNG1(-1742T>C，Ile581Thr)基因多态性在中国汉族人群中的分布特点经Hardy-Weinberg遗传平衡检验样本群体代表性[6]。结果LEDVT组字2=0.113，P=0.736；对照组字2=0.114，P=0.735。符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，说明样本来自一个较大的、随机婚配平衡状态的有一定代表性的群体。

2.3KNG1基因多态性检测结果分析KNG1基因位于1742位点T→C的突变，T-455等位基因为野生基因，C-455等位基因为突变基因，三种基因型分别为：-1742TT型(野生型)、-1742TC型(杂合突变型)、-1742 CC(纯合突变型)。PCR产物的大小为324 bp，三种基因型被DraIII酶切后产生了3种不同的DNA片段。C-455等位基因含有1个DraIII酶切位点，而T-455等位基因缺乏DraIII酶切位点，-1742TT型基因无法被酶切仍为324bp的片段，-1742 CC型基因酶切后产成116 bp、208 bp两条片段，-1742TC型基因酶切后产生116 bp、208 bp、324 bp三条片段。

2.4KNG基因频率分析两组KNG1(-1742T>C，Ile581Thr)三种基因型频率分布不同，差异有统计学意义(u=3.702，P<0.0005)。见表3。

表3两组KNG1(-1742T>C，Ile581Thr)基因型频率分布比较例(%)组别TT型TC型CC型病例组(n=143)41(29)73(51)29(20)对照组(n=150)52(35)74(49)24(16)3讨论HK肽链C末端附近含有组氨酸残基非常集中的肽段，并参与血液凝固反应，能加速激肽释放酶对凝血因子Ⅻ的激活。HK的作用则是作为XIIa和PK的辅因子，促进FXI和PK的激活，促进PK对FXII的激活，参与内源性凝血途径的接触活化。HK是激肽释放系统重要组成部分。

Merkulov等[7]研究发现，敲除KNG1基因的大鼠可延长部分凝血活酶时间，延缓动脉血栓的形成。Houlihan等[8]研究表明，在1477例老年人群中，KNG1基因与部分凝血活酶时间有显著的相关性。2011年，Morange等[9]在研究KNG1基因与静脉血栓关系中表明，Ile581Thr变种的KNG1是静脉血栓发生的一种新的危险因素。国内有关于KNG1基因与高血压关系的研究，在中国的汉族人群中，KNG1基因突变与原发性高血压有显著的相关性[10]。本实验研究发现，两组APTT、HK比较差异有统计学意义(P<0.05)，可认为LEDVT组的HK浓度高于对照组，APTT低于对照组。提示(1)血HK浓度升高可能是LEDVT的独立危险因素；(2)KNG1(-1742T>C，Ile581Thr)基因与APTT有关。按Hardy-Weinberg遗传平衡定律，公式计算结果：LEDVT组字2=0.113，P=0.736；对照组字2=0.114，P=0.735，说明样本来自一个较大的、随机婚配平衡状态的有一定代表性的群体。两组研究对象的三种基因型的对照结果显示：基因型频率构成比u=3.702，P<0.0005，同时研究发现，携带T-1742等位基因罹患下肢深静脉血栓的几率比携带C-1742等位基因的明显高。C-1742等位基因的结论与国外Houlihan和Morange的研究结果相近。提示KNG1-1742T>C基因多态性与下肢深静脉血栓形成相关，C-1742等位基因可能是下肢深静脉血栓形成的遗传危险因素。根据本研究结果可以对下肢深静脉血栓形成的临床防治提出以下建议：(1)KNG1-1742T>C基因多态性的检测可能会成为下肢深静脉血栓形成的一级预防的有效手段。(2)携带C-1742等位基因，或携带-1742CC+TC基因型基因型者下肢深静脉血栓的易感性较高，应该加强针对携带此易感基因的人群的预防保健工作。(3)生化检查中HK高于正常的人群，APTT低于正常人群者应当使用药物或者非药物的手段使其达到正常人群的水平，从而达到预防和治疗下肢深静脉血栓的目的。

参考文献[1]Colman R M，Schmaier A H.Contact system:a vascular biology modulator with anticoagulant，profibr inolytic，antiadhesive，and proinflammatory attributes[J].Blood，1997，7(90):3819-3843.

[2]Ohkubo，Masayasu K，Toshinaga M.Effect of His-Gly-Lys motif derived from domain 5 of high molecular weight kininogen on suppression of cancer metastasis both in vitro and in vivo[J].Biological Chemistry，2003，278(49):49301-49307.

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[7]Merkulov S，Zhang W M，Komar A A，et a1.Deletion of murine kininogen gene 1(mKng1)causes loss of plasma kininogen and delays thrombosis[J].Blood，2011，111(8):1274-1281.

[8]Houlihan L M，Davies G，Tenesa A，et a1.Common variants of large effect in F12，KNG1，and HRG are associated with activated partial thromboplastin time[J].Am J Hum Genet，2010，86(4):626-631.

[9]Morange PE，Oudot-Mellakh T，Cohen W，et a1.KNG1 Ile581Thr and susceptibility to venous thrombosis[J].Blood，2011，117(13):3692-3694.

[10]Zhao W，Wang Y，Wang L，et al.Gender-specific association between the kininogen 1 gene variants and essential hypertension in Chinese Han population[J].J Hypertens，2009，27(7):484-490.