多巴胺D3受体基因敲除对小鼠基础痛阈的调制作用临床医学论文.doc

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多巴胺D3受体基因敲除对小鼠基础痛阈的调制作用_临床医学论文作者：李林赖江华陈利萍朱俊艳陈腾【摘要】目的研究多巴胺D3受体对小鼠基础痛阈的调制作用，为进一步探讨D3受体在痛觉调制作用中的分子机制奠定基础。方法对实验小鼠进行适应性预处理后，用甩尾仪测定D3受体基因敲除小鼠(D3-/-)及具有相同遗传背景的野生型(C57BL/6J)小鼠的基础痛阈。结果D3受体基因敲除小鼠的基础痛阈高于野生型C57BL/6J小鼠，统计学检验显示两组间有显著性差异(P<0.05)。结论多巴胺D3受体可能参与痛觉的调制过程，对脊髓伤害性反射具有紧张性下调易化效应。对进一步在分子水平探讨多巴胺对痛觉调制作用机制奠定了基础。【关键词】多巴胺D3受体；基础痛阈；基因敲除小鼠脑内多巴胺(dopamine,DA)系统是参与调节人类躯体运动、精神活动以及精神依赖的重要递质[1]，随着中枢定位分析的逐渐精确以及特异性的DA受体(dopamine receptor,DR)亚型工具药的应用,中枢DA系统在痛觉调制中的作用越来越受到重视。由于既往关于DR对痛觉调制作用的研究多是通过给予多巴胺受体激动剂或拮抗剂来进行的，存在特异性及靶向性不强等不足，因此各家报道的研究结果很不一致[2]。而多巴胺D3受体基因敲除(dopamine 3 receptor knockout,D3RKO)小鼠具有基因定向敲除后特异性高等优势，因此为深入研究DA受体在痛觉调制过程中的作用提供了一条新途径。本实验通过对多巴胺D3受体基因敲除小鼠及野生型(C57BL/6J)小鼠进行基础痛阈测定来揭示多巴胺D3受体在痛觉调制过程中的作用。1材料与方法1.1实验动物及分组D3RKO小鼠(D3-/-)(由美国芝加哥大学徐明教授惠赠)以及具有相似遗传背景的野生型(wild type,WT)C57BL/6J小鼠(由西安交通大学实验动物中心提供)各8只，雌雄各半，体重20-25g。动物饲养在SPF(specificpathogen free)级动物房，恒温21℃。各组小鼠在层流架中分笼饲养，24h周期明暗交替照明,动物自由进食及饮水。1.2实验仪器甩尾痛觉测试仪(33 Tail Flick Analgesia Meter,ITC,USA)。1.3实验动物预处理在开始实验前2d对实验动物进行预处理。每天在同一时间和同一环境，由实验操作人员佩戴在实验小鼠鼠笼垫料中放置过的棉线手套在甩尾仪上安抚小鼠直至其保持安静状态，使其适应实验环境及操作过程。1.4基础痛阈测定用辐射热照射鼠尾，测定甩尾潜伏期(s)，连续3d，每天测试3次，每次间隔30s。辐射热照射强度为仪器65%强度，照射部位为小鼠尾部下2/3处，使小鼠的甩尾潜伏期在1.5-3s间。1.5统计学处理采用SPSS11.5软件对两实验组数据进行重复测量方差分析，P<0.05表示有显著性差异。2结果对资料进行球检验得近似χ2值为14.632，自由度为2，对应P值0.001，故进行GreenhouseGeisser多元重复测量方差分析，结果见表1、2。表1 D3RKO小鼠和C57BL/6J小鼠基础痛阈测定结果（略）Table 1 Baseline pain threshold of D3RKO mice and C57BL/6J mice**P<0.01 and*P<0.05 vs.C57BL/6J group on the same day表2各项统计学参数（略）Table 2 Statistical parameters 3讨论多巴胺受体包括D1、D2、D3、D4、D5五种亚型。由于D1和D5受体分子同源性超过80%及与兴奋性G蛋白(Gs)耦联等共同特性,在药理学特征上与传统的D1亚型受体相似，因此统称为D1样受体(D1like receptors)。D2、D3和D4受体分子同源性约为45%，受体基因有4-6个内含子，无棕榈酸酯化作用，均与抑制性G蛋白(Gi)相耦联，在药理学特征上与传统的D2亚型受体相似，故统称为D2样受体(D2like receptors)[3]。既往对多巴胺受体功能的研究主要是通过给予拮抗剂或激动剂的方法进行。对于D3受体，常用的配体有四氢萘满类、LY171555、PD128907、(+)S14297等，是D3受体激动剂或拮抗剂。由于D3受体与D2、D4受体结构上高度同源，空间分布上部分重叠使得这些配体都只是部分性的激动剂或拮抗剂，并不能起到D3受体专一性拮抗或激动，因此就使得在此基础上研究结果的可信度受到一定影响。本实验所用的D3RKO小鼠是以野生型C57BL/6J小鼠为基础，通过由PGK(phosphoglycerate kinase)启动子调控的neo(neomycin resistance)基因替代多巴胺D3受体第一外显子以敲除D3受体基因。与野生型C57BL/6J小鼠相比，该敲除小鼠无显著生理学异常，可以正常繁殖、生长，其繁殖后代的数量、体形及性别无明显异常。经脑内D1、D2受体结合实验、多巴胺放射自显影分析、酪氨酸羟化酶免疫实验等研究证实，其多巴胺系统除缺少D3受体以外，与野生型C57BL/6J小鼠相比无明显差异，因此是研究D3受体功能的理想动物模型[4]。以往研究表明多巴胺系统主要通过D2样受体参与对痛觉的调制[58]。在大鼠辐射热测痛模型上分别腹腔注射D1和D2样受体特异性激动剂和拮抗剂，发现只有D2样受体的选择性拮抗剂Spiperone有镇痛作用,而其激动剂和D1样受体选择性的激动剂SKF38393以及拮抗剂SCH23390均对痛阈不产生显著影响。静脉注射D2样受体拮抗剂氟哌啶醇(Haloperidol)也产生了镇痛作用。类似的结果还有：皮下注射D2样受体激动剂溴麦角环肽(bromocriptine)对基础痛阈无影响；皮下注射D1样受体激动剂SKF38393或D2样受体特异性的激动剂LY141865,发现前者对基础痛阈无影响,而后者产生了痛敏；在小鼠测痛模型上腹腔注射SKF38393和溴麦角环肽对基础痛阈也无影响。表明D2样受体对痛阈有紧张性易化的作用[2]。最近Heikki Mansikka等[9]通过对D2受体基因敲除小鼠的研究发现D2RKO小鼠对辐射热刺激的基础痛阈有所上升但很轻微，即在内源性多巴胺对痛觉的调制作用中，D2R参与其中，起到紧张性易化作用，但并不起主要作用。这进一步提示，D3R或D4R在D2样受体对痛阈的调制过程中起更大作用。本研究结果显示D3RKO小鼠对于辐射热刺激的基础痛阈明显高于野生型的C57BL/6J小鼠，提示多巴胺D3受体在神经系统参与痛觉的调制过程中起一定作用，主要引起基础痛阈降低，亦即在正常小鼠D3R对基础痛阈有紧张性易化作用。中脑边缘多巴胺系统(MLDS)途径是奖赏效应过程中传递多巴胺的专一性通路，是公认的与成瘾有关的最重要的脑区。Xu等[4]对D3RKO小鼠的研究表明，D3RKO小鼠对可卡因的敏感性增强，对安非它明的条件性位置偏爱增高，提示D3R对机体的成瘾过程也主要起抑制作用。同时，中脑边缘多巴胺系统与脊髓SmVLOPAG脊髓组成的痛觉调制通路[10]有着密切的联系，并且各种各样的精神及躯体依赖性药物如苯丙胺类、阿片类等，都具有一定的镇痛及产生幻觉的作用，使人精神亢奋或飘飘欲仙，感觉舒爽，有些成瘾性药物如杜冷丁本身就是由于镇痛作用而导致机体最终成瘾，据此我们推测，多巴胺D3受体对痛觉的调制过程可能是影响机体成瘾的一个重要环节。本实验的研究结果显示D3受体可以使小鼠痛觉敏感，即舒爽与疼痛、成瘾与抑制成瘾这两对相互对抗作用都在D3受体的功能中得到体现，因此，对D3受体参与痛觉调制作用的研究可能会对进一步研究DA系统在药物成瘾中的作用提供新的理论支持。【参考文献】[1]韩济生.神经科学原理[M].第二版.北京：北京医科大学出版社,1999:500505.[2]高秀，吴根诚.中枢多巴胺系统在痛觉调制中的作用研究[J].国外医学.生理、病理科学与临床分册,2001,21(4):309311.[3]Kebabian JW,Calne DB.Multiple receptors for dopamine[J].Nature,1979,277(5692):9396.[4]Ming Xu,Timothy EK,Giovanni TS.Dopamine D3 receptor mutant mice exhibit increased behavioral sensitivity to concurrent stimulation of D1 and D2 receptors[J].Neuron,1997,19:837848.[5]Roame DS,Bounds JK,Ang CY,et al.Quinpitoleinduced alterations of tail temperature appear as hyperalgesia in the radiant heat tailflick test[J].Pharmacol Biochem Behav,1998,59(1):7782.[6]FrussaFilho R,Rocha TB,Conceicao IM,et al.Effects of dopaminergicagents on visceral pain measured by the writhing test[J].Arch Int Pharmacodyn Ther,1996,331(1):7493.[7]高秀，辛冰牧，朱崇斌，等.大鼠鞘内注射多巴胺受体激动剂与拮抗剂对痛及针刺镇痛的影响[J].生理学报,1998,50(1):4348.[8]汪海宏，许沼芬.多巴胺D1和D2受体拮抗剂对针刺镇痛的增强[J].生理学报,1993,45:6168.[9]Heikki M,Eric E,Emiliana B,et al.Influence of the dopamine D2 receptor knockout on painrelated behavior in the mouse[J].Brain Res,2005,1052:8287.[10]唐敬师，袁斌.一个新的痛觉调制通路的发现[J].西安交通大学学报(医学版),2002,23(4):329332.