线栓法致大鼠局灶脑缺血模型的评价及思考药学论文.doc

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线栓法致大鼠局灶脑缺血模型的评价及思考_药学论文作者：陈小睿孟宪丽孟保华李佳川【摘要】目的基于实验经验的总结，重点介绍线栓法致大鼠局灶性脑缺血模型的制作方法及操作程序，为建立较为稳定的脑缺血模型提供参考。方法采用线栓自颈总动脉插入，经颈内动脉阻断大脑中动脉以造成局灶性脑缺血模型，测定各组脑组织含水率及梗塞体积比。结果模型组脑组织含水率及脑梗塞体积比明显高于假手术组；阳性药尼莫地平能明显减轻线栓模型损伤引起的脑组织缺血，降低脑含水率和脑梗塞体积。结论通过对线栓法模型进行改良，可有效缩短造模时程，减少手术损伤，提高再灌注后存活率，使造模效果趋于稳定。【关键词】线栓法；脑缺血；动物模型Abstract：ObjectiveBased on the summary of the experiences from experiments,the method for model building and the details of manipulation of the model of focal cerebral ischemia by suture-occluded in rats were emphasized in this article in order to build steadier models.MethodsThe suture was inserted via CCA into ICA to block MCA for building the MCAO model of rats and then the water ratio and the percentage of the infarcted volume of the brain tissue were measured.ResultsThe water ratio and the percentage of the infarct volume of the model group were significantly higher than those in sham operated group.As the positive comparison,Nimodipine could significantly relieve the impairment caused by MCAO and decrease the water ratio and the percentage of the infarct volume.ConclusionThe suture-occluded method shorten the time,relieve the impairment in OPS,heighten the livalility after reperfusion and the model is steady.Key words：Suture-occluded method;Cerebral ischemia;Animal model缺血性脑卒中是一种常见的脑血管疾病，其发病率、致残率和病死率高，严重威胁着人类的健康和生命安全，因此防治脑缺血药物的研究已成为当今医学研究热点之一。如何在动物实验中建立相对稳定的、能模拟临床病理机制且操作简便易行的模型则是基础研究的关键问题所在。大脑中动脉（MCA）为临床上缺血性脑损伤的易患部位，故MCA阻断模型被广泛用于脑梗塞的研究［1］。近年来应用较为广泛的造模包括：经颞下或经眶入路直接电凝或结扎法、线栓法、光化学诱导血栓法等［2］。其中，线栓法无需开颅，损伤小，成功率相对较高，可避免外源注入栓子造模的随机性和缺血部位的不可预测性，能实现脑缺血再灌注损伤的研究。笔者通过对Longa线栓法进行改进，并在多次的实验操作中积累了相关经验。1材料1.1动物清洁级SD大鼠，雄性，体重250～350 g，由四川省医学科学院实验动物研究所提供。合格证号：SCXK(川)2004－15。自由饮水进食，适应性喂养1周。术前12 h禁食。1.2线栓的制备直径0.26 mm优质黑色尼龙鱼线（产地日本），剪取约7 cm长线段，将一端插入液体石蜡并迅速提起，垂直晾干，让石蜡自然下滴均匀覆盖前端线身。成品线栓显微镜下线头呈水滴状，线身直径达0.28 mm，自此端始20 mm处修正液作一标记备用。2方法2.1手术操作步骤10％水合氯醛0.35 ml/100 g腹腔注射麻醉大鼠。仰卧位固定，术区常规消毒，颈正中线切口，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉筋膜及右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），在CCA远心端和近心端及ECA处挂线备用。近心端结扎CCA，ECA。然后在距CCA分叉部4mm处剪一小口，将栓线插入到ICA，用眼科镊轻推栓线，当插入深度在20mm左右（修正液标记处到达ECA，ICA分叉处），感觉推进有阻力时，系牢ICA及CCA远心端的备线以固定线栓。逐层缝合切口并消毒，剪短留在体外的线栓，以备再灌注之用。庆大霉素肌注预防感染，术后保温至动物清醒，分笼饲养观察。阻断后2 h，拔出线栓，进行再灌注。苏醒后出现提尾时左前肢屈曲和前进时左侧划圈征，证明右侧大脑中动脉阻塞成功。2.2实验分组将动物按体重随机分层分为假手术组、模型组及阳性组3组，每组10只。阳性组按设计剂量灌胃每天给予尼莫地平片溶液1 ml/100 g（1.4 mg/100 g），1次/d，连续给药7 d，假手术组给予等容蒸馏水。于第7天灌胃给药1 h后，假手术组大鼠仅在麻醉状态下分离右侧颈总动脉，不予阻断血流。阳性组和缺血模型组用“2.1”所示方法建立大鼠右侧大脑中动脉栓塞模型。阻断后2 h，拔出线栓，进行再灌注。再灌注23 h后给药1次，于第24小时断头处死动物取脑。2.3缺血脑组织含水率的测定动物迅速断头处死取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，置于培养皿中，滤纸吸干表面水分，电子天平精确称量湿重并记录，入烘箱105℃烘干48 h后取出，经反复称量直至恒重后记录作为组织干重。用干湿重法求得含水率。公式如下：脑组织含水率（%）=（湿重－干重）/湿重×100％2.4缺血脑组织梗塞比例测定动物迅速断头处死取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，置于培养皿中，生理盐水冲洗，滤纸吸干表面水分，入超低温冰箱急冻20 min，取冠状面均匀切成2 mm的厚脑片，第1刀在脑前极与视交叉连线中点处；第2刀在视交叉部位；第3刀在漏斗柄部位；第4刀在漏斗柄与后叶尾极之间。迅速放入1%TTC溶液中，避光37℃温孵30 min，其间每隔5 min翻动一次，使均匀接触到染色液。经染色后的正常脑组织呈玫瑰红色，而梗塞组织呈苍白色，且界限分明，易于剥离。温孵完毕后将脑片置于10%甲醛中避光固定。24 h后取出5片脑片，电子天平精密称取总重并记录。眼科镊精确剥离梗塞部位，精密称量并记录。脑梗塞比例测定采用下述公式：脑梗塞比例（％）＝（梗塞部分重量/全脑重量）×100％2.5统计学处理采用SPSS 13.0 for windows软件进行统计学处理。3结果3.1术后神经功能观察术后约1 h大鼠苏醒，假手术组无神经功能症状。脑缺血模型组和阳性组大鼠清醒后，提尾悬空时出现左前肢腕屈、肘屈曲、肩内旋，右侧Horner’s征阳性。置于平台时，前进中出现咬尾征（往左侧划圈），证明造模成功。3.2各组大鼠脑组织含水率变化见表1。表1线栓法致大鼠局灶性脑缺血再灌注模型对脑组织含水率的影响（略）模型组与假手术组比较，*P<0.01；与尼莫地平组比较，△P<0.01；n=10结果表明，线栓法致大鼠局灶性脑缺血再灌注模型对大鼠脑组织含水率的影响实验中，模型组与假手术组相较，P<0.01，差异有统计学意义；模型组与阳性药尼莫地平组比较，P<0.01，差异有统计学意义。3.3各组大鼠脑组织梗塞率变化见表2。表2线栓法致大鼠局灶性脑缺血再灌注模型对脑组织梗塞率的影响（略）模型组与假手术组比较，*P<0.01；与尼莫地平组比较，△P<0.01；n=10结果表明，线栓法致大鼠局灶性脑缺血再灌注模型对大鼠脑组织梗死率的影响实验中，模型组与假手术组相较，P<0.01，差异有统计学意义；模型组与阳性药尼莫地平组比较，P<0.01，尼莫地平能减轻线栓以及再灌注损伤引起的脑组织缺血程度，差异有统计学意义。4方法改进及经验思考线栓法具有创伤小，操作相对简便，缺血定位统一，可再灌注等优点。但线栓进入颈内动脉后，非直视状态下的操作不利于走行路线的调整，入颅后MCA阻断与否无法直接判断。线栓的加工、插入深度等都应根据大鼠的品系和体重进行相应调整。如何尽可能缩短手术时程，减少手术损伤，提高再灌注后存活率，是值得探讨的问题。4.1材料的选择和预处理4.1.1线栓的选择应选择适合直径之鱼线。对于体重250～300 g之大鼠，鱼线适合直径在0.24～0.26 mm之间，石蜡包裹后在0.26～0.28 mm。鱼线应选择质量较好，表面光滑，柔软而坚韧者，硬度不够不利于在血管中的推进，硬度过高易造成血管壁损伤。为方便再灌注时迅速找到预留的线尾，减轻对动物的扰动，可选择与大鼠毛色对比鲜明的深色鱼线，同时方便观察线栓入颅前在血管中走行路径。4.1.2线栓的预处理锐利剪刀迅速垂直线身截取，保证断面平直不尖锐。将线头没入液体石蜡3 cm以上，迅速提出，竖直悬吊晾干，令石蜡自由顺线身滴下，以保证包裹均匀。显微镜下观察，线头呈水滴状，线身均匀平滑即可。从线头端起20 mm处，修正液标记。对于体重250～300 g之大鼠，一般可插入深度约20 mm左右。酒精消毒备用。4.1.3实验动物的选择经典的局灶性脑缺血模型选用SD大鼠。体重要求在250～300 g。刘氏［3］在研究中发现，体重大于350 g大鼠颅内血管增粗，难以充分阻断MCA血流，体重小于240 g，手术操作难度较大。辛氏等［4］的研究结果认为大鼠体重250～330 g，线长17 mm或18 mm，线栓直径0.28 mm的配合方案较为稳定优越。笔者曾选用200 g雄性大鼠，直径0.22 mm线栓造模预试，8 h存活率仅10％，可推断个体较小之动物对手术操作耐受较差。实验应选用雄性大鼠，以排除雌激素对脑缺血的保护作用。4.1.4麻醉药的选择多采用水合氯醛进行麻醉。水合氯醛具有价廉、配制储存简便易行之特点，动物一般能于术后2 h左右清醒，有利于造模成功与否的判定以及行为学的观察。4.1.5术前禁食术前12 h必须禁食，可自由饮水。实验证明［5］高血糖条件下，脑缺血再灌注后脑组织梗塞面积及神经功能缺损症状会显著加重，死亡率明显增加。4.2术中操作要点4.2.1常规消毒术区，开颈后用镊子小心分离组织，仔细剥离颈总动脉，应尤其小心分离伴行的迷走神经。在距离ECA和ICA分叉5 mm处用眼科剪45°剪开血管，切口应注意尽量小。用止血钳牵拉备于ICA的手术线可防止切口出血。4.2.2线栓插入血管后即放开ICA备线处止血钳。用眼科镊钳住线栓中段往前推进，推进时可适当牵拉颈总动脉的备线，保证推进顺畅。推进过程中，约在线栓进入分叉10mm左右，有时会感觉有阻力，系由线栓穿颅时遇到狭窄所致，此时硬行推入易损伤血管。应将线栓退至切口处，调整方向重新插入。应注意线栓在血管里多次进退可诱发血小板、白细胞黏附，损伤或刺激血管内皮细胞引起某些活性物质释放诱发血栓［6］，造成动物存活时间缩短。4.2.3当修正液所作20 mm标记通过ICA和ECA分叉处后，有时仍可继续推进，但当感觉推进受阻时，应适当退留一点空间，否则易致蛛网膜下腔出血（SAH）。4.2.4整个手术时程不宜超过20 min，否则大鼠容易死亡。4.3术后护理工作4.3.1术后保温术后动物尚未清醒时，必要的保温措施可减少死亡率。可用60W的白炽灯距离大鼠50 cm高度持续照射，待清醒后再撤除。过夜应将室温稳定在25℃左右为宜。低温低代谢状态对脑缺血有保护作用，而温度过高会加重脑缺血损伤，甚至导致动物死亡。4.3.2再灌注拔线速度拔线过快，会导致蛛网膜下腔出血甚至拉断血管，导致动物死亡。现今有关脑缺血的基础与临床研究均取得了显著成效。作为普及面广，操作相对简便的动物模型，线栓法也在不断的实践中得到验证和改进。但由于影响因素较多，如何规范和优化手术操作，降低死亡率，使模型梗塞体积恒定，更能模拟人类发病机理，仍是亟待解决的问题。【参考文献】［1］黄斌，王兴勇，匡凤梧，等.线栓法制备Wistar大鼠局灶性脑缺血模型的实验研究［J］.现代医药卫生，2005，21(15)：1935.［2］刘喆，赖新生.大脑中动脉闭阻脑缺血模型大鼠的建立与评价［J］.中国行为医学科学，2005，14(10)：877.［3］刘亢丁，苏志强，李逸平，等.实验性局灶性脑缺血再灌注动物模型的改进与评价［J］.中风与神经疾病杂志，1997，14(2)：87.［4］辛世萌，刘远洪，聂志余.栓线长度、直径、及大鼠体重与栓线法大鼠局灶性脑缺血模型关系的研究［J］.大连医科大学学报，2000，22(2)：105.［5］贾茜，朱梅佳.胰岛素受体与VEGF［J］.国际病理科学与临床杂志，2005，5(25)：453.［6］刘敬霞，李建生.线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型的进展及评价［J］.中国比较医学杂志，2004，14(6)：374.