多负荷因素联合对小鼠上肢肌肉抗脂质过氧化反应的影响药学论文.doc

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多负荷因素联合对小鼠上肢肌肉抗脂质过氧化反应的影响_药学论文作者：戴文涛,赵晓蓉,杨翠婵,符古雅,李伯灵,余日安【摘要】目的探讨多负荷因素联合对小鼠上肢肌肉抗脂质过氧化反应的影响。方法昆明种雄性小鼠54只，随机分9组，对各组上肢肌肉均施以3种负荷因素(固定天数、每日固定时间和固定姿势)、每因素高低两种水平的肌肉负荷后，检测各组上肢肌肉超氧化物歧化酶(SOD)和氧化亚氮合酶(NOS)活性，分析三负荷因素对SOD和NOS活性的影响。结果固定7 d组SOD活性比正常对照组及14 d组高(P<0.05)，所有实验组NOS活性均比正常对照组高(P<0.05)。结论多负荷因素联合作用早期小鼠上肢肌肉抗氧化作用增强。【关键词】肌肉骨骼疾患;抗氧化作用;超氧化物歧化酶;氧化亚氮合酶;小鼠Abstract:Objective To study the effects on antilipid peroxidation in upper limb muscles in mice by different load factors in combination.Methods 54 mice were randomized into 9 groups，and three kinds of load factors for 7 days or 14 days for each factor,i.e.,immobilization days,immobilization duration per day,and forced posture,were loaded to upper limb muscles in mice in each group,and then superoxide dismutase(SOD)activities and nitric oxide synthase(NOS)activities of upper limb muscles of mice in each group were examined,and the effects of the three kinds of load factors on SOD and NOS activities in upper limb muscles of mice were analyzed.Results SOD activity of the upper limb muscles in mice of the 7day immobilization group was higher than those in the control group and 14day immobilization group(P<0.05),and NOS activities of the upper limb muscles in mice in all of the test groups were higher than that in the control group(P<0.05).Conclusion The antilipid peroxidation of the upper limb muscles in mice increased in the early stage when loaded with different load factors in combination.Key words:musculoskeletal disorders;the antilipid peroxidation;superoxide dismutase;nitric oxide synthase;mice职业性肌肉骨骼疾患(occupational musculoskeletal disorders，OMDs)是严重影响职业生命质量和劳动生产率的职业相关疾病，是发达国家职业病赔偿的主要病种，在发展中国家造成的损失也越来越大[1]。关于OMDs的研究，有助于辨明其发病危险因素，继而针对劳动环境、作业负荷和劳动组织等OMDs危险因素采取有效的干预措施，降低发病率。近年，多因素负荷联合对肌肉应激的影响是OMDs的研究热点[1]。脂质过氧化与抗脂质过氧化反应是肌肉正常的应激过程，也是肌肉应激状态的反映，可以用于研究多负荷因素下肌肉的反应。本实验利用间歇性强迫体位小鼠模型，探讨多负荷因素联合作用对小鼠上肢肌肉抗脂质过氧化的影响。1材料与方法1.1实验动物及分组健康SPF级昆明种雄性小鼠54只，体质量(34.0±3.0)g，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(粤)20080002。随机分成9组，每组6只。各组分笼饲养，自由饮食，自然光照，室温(27±3)℃。动物分组参考Dai WT等[2]的实验分组设计，按实验动物上肢肌肉负荷因素和负荷水平，即三因素(固定天数、每日固定时间、固定姿势)两水平(固定天数7、14 d;单次固定1、2 h;固定姿势为四肢外展0°、90°)，各因素和水平间进行所有可能的组合，成2×2×2分组，共计8个实验组。另设正常对照组。见表1。广东药学院学报第25卷第6期戴文涛，等.多负荷因素联合对小鼠上肢肌肉抗脂质过氧化反应的影响表1实验分组1.2动物固定实验期间，每天上午9时开始，用细棉绳将小鼠四肢腕部绑缚，仰面固定于木板上的四颗固定的铁钉间，四肢处于被动牵拉状态，木板放置与地面成45°夹角。四肢外展90°固定如图1所示，四肢外展0°固定如图2所示。正常对照组不固定，于笼内饲养14 d。1.3组织匀浆的制备所有小鼠于实验的第7天、第14天下午3时脊椎脱臼处死，取双侧上臂肌肉，制备成10%和1%的组织匀浆，分别用于过氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性及蛋白含量的测定;余下的10%组织匀浆上清液用于氧化亚氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)活性的测定。1.4生化指标测定蛋白含量测定采用考马斯亮兰法;SOD活力测定采用黄嘌呤氧化酶法;NOS活力测定采用NOS测定试剂盒;以上试剂均购自南京建成生物工程研究所第一分所，均严格按照试剂盒说明书操作。1.5统计学分析采用SPSS11.5软件，进行随机资料的t检验或配对资料的t检验，以P<0.05为差异有显著性。2结果2.1多负荷因素联合对小鼠上肢肌肉SOD、NOS的影响固定7 d组SOD活性高于正常对照组水平(P<0.05)，固定14 d组SOD活性与正常对照组间差异无显著性(回到正常对照组水平);所有实验组的NOS活性均高于正常对照组(P<0.05),见表2。2.2固定天数对小鼠上肢肌肉SOD、NOS活性的影响固定7 d组SOD活性最大值在0°固定2 h组[(104.3±8.5)U/mg prot];NOS活性最大值在90°固定1 h组[(2.3±0.6)U/mg prot]。固定14 d组，SOD、NOS活性最大值均在0°固定2 h组，分别为(99.0±10.2)U/mg prot、(1.9±0.4)U/mg prot。除0°固定2 h组外，固定7 d组SOD活性比固定14 d组高，差异具有显著性(P<0.05)。表2固定天数对小鼠上肢肌肉SOD、NOS活性的影响与14 d比较：*P<0.05(t检验);四组总体上，7 d与14 d组相比：**P<0.05(配对资料的t检验);四组总体上与正常对照组相比：#P<0.05(随机资料t检验)2.3每日固定时间、固定姿势对小鼠上肢肌肉SOD、NOS的影响3种情况下，每日固定时间高低负荷水平(1 h与2 h)间SOD、NOS活性差异有显著性(P<0.05)，即：(1)外展0°固定14 d时;(2)外展90°固定7 d，时;(3)外展0°固定7 d时。但从总体上看，每日固定时间对小鼠上肢肌肉SOD、NOS活性无显著影响(P>0.05)。同时，另外3种条件下，固定姿势高低负荷水平(90°与0°)间SOD、NOS活性差异有显著性(P<0.05)：(1)每日2 h固定14 d时，SOD活性为73.3±13.5与99.0±10.2;(2)每日1 h固定14 d时，NOS活性为1.43±0.4与1.8±0.3;(3)每日2 h固定14 d时，NOS活性为1.3±0.3与1.9±0.4。将所有数据综合分析，未发现固定姿势对小鼠上肢肌肉SOD、NOS活性有显著影响(P>0.05)(各组数据均已在表2中列出，重新排列的数据表略去)。表3每日固定时间对小鼠上肢肌肉SOD、NOS活性的影响3讨论Barbe MF等[4-6]建立了一系列较为完备的上肢动态作业负荷动物实验模型，探讨了动态作业中小鼠肌肉负荷与应激之间的关系。但是在动态作业中，常常存在某些关节及其肌肉长期保持相对固定的角度和状态的情况，如视频终端(video terminal device,VTD)作业中，颈、肩、肘关节常长时间保持固定角度，使很多作业者上述关节在某一特定角度时会引出剧烈疼痛[4]。这提示，对于固定姿势下肌肉的应激反应的研究很有必要。过去的研究显示，与化学毒物相比，负荷姿势、负荷时间等因素对肌肉组织的影响较小[2]。本实验中的动物进行2×2×2所有可能的组合分组，每组动物都同时被施以3种负荷因素，但剂量水平不同;数据分析时，着重讨论其中的两个因素、水平完全一致时，另外一种因素高、低水平之间的差异，这样，有利于尽可能地抵消动物个体差异对实验结果的影响。OMDs的发生与多种负荷因素的联合作用有关[1]，探讨多负荷因素联合作用下的肌肉应激反应，有助于分清不同负荷因素在OMDs发病中的作用大小，有助于针对OMDs主要危险因素采取重点防护。本实验中，固定天数模拟作业班次数，每日固定时间模拟单班作业负荷量，固定姿势模拟作业姿势负荷量。实验结果对于劳动组织和劳动强度设定有借鉴意义。脂质过氧化及抗氧化反应是机体的正常过程，肌肉负荷(如牵拉)会引起肌肉组织脂质过氧化作用的增强，中间产物丙二醛升高，引起肌肉组织损伤，机体的抗脂质过氧化物质也会发生相应变化[7]。SOD是体内主要抗氧化酶，属于抗脂质过氧化应激的酶性防御机制。一般认为，个体活性氧簇水平增加可导致抗氧化酶活力的应激性增加[8]。SOD作为机体抗氧化酶类的一种特异催化剂，能促使超氧自由基分解，清除体内有害的氧自由基，对机体内的氧化和超氧化起平衡作用，消除其对机体的损害。本实验中，固定7 d组的SOD活性比固定14 d组高(P<0.05)，14 d实验组SOD活性与正常对照组比较差别无显著性，提示早期应激中SOD活性较高，随着应激时间的延长，抗氧化应激水平下降至平时水平。该结果与刘晓莉[9]等的研究相似。NOS是催化生物体内氧化亚氮(nitric oxide，NO)生成的唯一酶类。而NO作为一种抗脂质过氧化的物质，可与脂质、OH、过氧化氢自由基反应，终止脂质过氧化的链式反应，保护组织和脏器免受脂质过氧化作用损害。当体内脂质过氧化水平升高时，NOS活性应激性升高，合成大量NO，保护机体免受脂质过氧化损害。本实验中，14 d组和7 d组NOS活性均较正常对照组显著升高，提示NOS的应激维持时间比SOD更长，更适合于作为肌肉多负荷因素应激的长期生物标志物。Tessier F等[10]也有相似研究结果。实验显示，固定天数高低负荷水平组间SOD活性差异有显著性，而每日固定时间、固定姿势高低负荷水平组间SOD、NOS活性差异均无显著性，提示在3种负荷组，固定天数对SOD活性影响最大。至于每种负荷对SOD活性影响的具体定量关系，还需进一步探讨。【参考文献】[1]MARRAS W S,CUTLIP R G,BURT S E,et al.National occupational research agenda(NORA)future directions in occupational musculoskeletal disorder health research[J].Appl Ergon,2009,40(1):15-22.[2]DAI W T,ZHAO X R,WANG Z L,et al.Electromyographical study on muscle fatigue in repetitive forearm tasks[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2007,27(4):358-361.[3]ELLIOTT M B,BARR A E,CLARK B D,et al.High force reaching task induces widespread inflammation,increased spinal cord neurochemicals and neuropathic 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