不同地理株柔嫩艾美耳球虫杂交虫株F2的培育及体外培养技术的建立动物医学论文.doc

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不同地理株柔嫩艾美耳球虫杂交虫株F2的培育及体外培养技术的建立_动物医学论文【中文摘要】鸡球虫病是危害现代化养鸡业的重大疫病之一。多年来众多科学家对本病进行了大量的研究工作。先后研制出大量抗球虫药物，并应用于临床实践。但由于耐药虫株的出现及残留药物对人体的危害，使药物防治受到限制。免疫预防已成为当前研究的热点，就目前的研究看：球虫的免疫机制尚未完全阐明，不同种株球虫共有的保护性抗原尚未得到，已有的疫苗不能对所有种或同一种不同株的球虫产生完全保护性免疫。国外的研究者已利用单卵囊杂交技术培育杂交虫株，并获得杂交亲本株的遗传标记：如共同抗原等。这方面的报道在耐药虫株的研究中较多。本研究将来自不同地域的野毒株柔嫩艾美耳球虫(甘肃株、北京株、吉林株)，采用单孢子囊接种技术培育各株单孢子囊后代，利用RAPD技术进行多态性分析，培育出杂交株F2，且在RAPD中出现了特有条带，并将F2进行体外培养。具体内容如下：杂交亲本株的选择：用五个不同地理株Eimeria.tenella，即：黑龙江株、山东株、吉林株、北京株、甘肃株，对10日龄雏鸡分别进行免疫攻虫，通过OPG计数，粪便计分，盲肠病变计分，增重测定，计算保护率，选择了免疫原性好且具有较强免疫保护力的甘肃株、北京株、吉林株。RAPD分析方法的建立：应用RAPD(随机引物扩增多态性DNA)技术，对三个杂交亲本株甘肃株、北京株、吉林株及它们的子代虫株进行了分析(14条随机引物)。在RAPD分析过程中，发现甘肃株、北京株、吉林株之间存在差异，相似值为0.6022～0.6971，平均为0.6497。各亲本株与子代株也存在差异，相似值为0.9838～0.9913，平均值为0～9876。根据相似值，列出了相似性矩阵，并绘制了亲缘关系树状图，从而建立了应用RAPD技术鉴定不同地理株柔嫩艾美耳球虫的方法。杂交虫株的培育：利用杂交技术对甘肃株、吉林株、北京株进行了杂交，通过单孢子囊技术分离杂交后代，并进行单孢子囊扩增。依据建立的RAPD分析方法，对13个甘肃株与吉林株杂交后代的单孢子囊扩增产物进行了分析，在分析中发现有一个单孢子囊扩增产物的RAPD谱带与其它不同，且其与两亲本株和子代株的相似性也与其它虫株不同，即：此虫株与两亲本株间的相似值为0.7598～0.8813，远远小于子代株与亲本株平均相似值0.9876，又远远大于株间相似值的平均值0.6497。依据亲缘关系树状图，确定该虫株为甘肃株与北京株的杂交虫株(杂交一代，F1)。获得的杂交F1进一步与北京株进行杂交(杂交二代，F2)，并用RAPD方法对13个杂交后代单孢子囊扩增产物进行分析，找到了一株与亲本株相似性为0.7658～0.8831的虫株，依据亲缘关系树状图，确定其为杂交F2株。体外培养的建立：将杂交株F2接种于10-12日龄的鸡胚尿囊腔，经过连续加大剂量和增加接种胚数的方法，促使球虫逐渐适应鸡胚，最后直线传至第9代，球虫已适应鸡胚，接种剂量由每胚4万条子孢子降至1万条，一直传至22代，建立起F2株的鸡胚适应株。本研究利用杂交技术，将不同地理株的柔嫩艾美耳球虫混合感染雏鸡，鸡体内配子发生随机交配，将获得等量的母型和杂交型合子，收集所产生的卵囊，通过RAPD技术鉴定、分离出杂交虫株，以获其杂交后代，此杂交后代进一步传代或直接分析，可以找到来自不同地理株的共同保护性抗原，进而为研制适合不同地理株的球虫疫苗提供了实验依据和理论基础。