家族性肌萎缩硬化症酵母研究模型的探索医学论文.doc

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家族性肌萎缩硬化症酵母研究模型的探索_医学论文作者：张小华王跃嗣牛新华【摘要】目的构建铜锌超氧化物歧化酶（SOD1）基因缺失的酿酒酵母菌株,为进一步以酵母为模型开展家族性肌萎缩硬化症发病机制及防治研究奠定基础。方法运用LFHPCR构建了带有遗传霉素抗性基因（KanMX4）的SOD1基因中断框，转化酿酒酵母BY5677，以添加G418的平板筛选出SOD1基因缺失菌株，并经PCR鉴定。结果PCR扩增证实SOD1基因已被成功敲除；与野生菌株相比，SOD1基因缺失菌株生长缓慢。结论成功构建了SOD1基因缺失的酿酒酵母菌株。【关键词】家族性肌萎缩硬化症；酿酒酵母；SOD1；LFHPCR【Abstract】Objective To construct the SOD1 gene deletion mutant of Saccharomyces cerevisiae and lay a foundation for studying the pathogenesis and treatment of familial amyotrophic lateral sclerosis based on the yeast model.Methods The SOD1:KanMX4 gene deletion fragment was constructed by long flanking homology LFHPCR and transferred to yeast strain BY5677.The SOD1 gene deletion mutant was selected on plates containing G418 and confirmed by PCR.Results The PCR analysis showed that SOD1 gene in the yeast strain BY5677 was deleted，compared with the wildtype strain,the SOD1 gene deletion mutant grew slowly.Conclusion An SOD1 deletion mutant was successfully constructed.【Key words】familial amyotrophic lateral sclerosis，Saccharomyces cerevisiae，SOD1，LFHPCR家族性肌萎缩侧索硬化症（familial amyotrophic lateral sclerosis,FALS）是一种进行性致死性神经系统变性疾病，5%～10%的患者有家族性，其主要临床表现是肌肉逐渐萎缩无力，患者最后会因呼吸衰竭而死亡［1，2］。目前研究认为FALS的发病与铜锌超氧化物歧化酶(Cu／Zn superoxide dismutase，SOD1)基因突变有关，但是其具体机制尚不清楚［3］。SOD1基因从酵母到人具有高度的保守性［4］，作为一种模式生物，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)已经广泛的被运用于人类遗传疾病研究［5，6］。本文利用LFHPCR技术,构建SOD1基因缺失的酵母菌株，对家族性肌萎缩硬化症酵母研究模型的建立进行了探索。1材料与方法1.1菌种和质粒酿酒酵母BY5677(MATa leu2～3/112 ura3～1 trp161 his3～11/15 ade2～1 can1～100 GAL SUC2 mal0)由日本酵母遗传中心提供。酵母质粒pLEJ009由美国明尼苏达州大学David T.Kirkpatrick教授惠赠。1.2主要试剂和仪器pfu DNA聚合酶、胶回收试剂盒、G418购自北京全式金公司。酵母粉、蛋白胨、鱼精DNA购自上海生工公司，其它化学试剂均为国产分析纯。引物委托上海博亚公司合成。1.3培养基酵母用YEPD培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，酵母粉10 g，加蒸馏水至1 000 ml，pH 6.0～6.5,8磅30 min灭菌。固体培养基添加2%(W/V)的琼脂。1.4酵母基因组DNA的提取取15 ml的酵母过夜培养物，离心收集菌体，用0.5 ml的无菌水悬浮，13 000 r/min离心30 s，加200μl的裂解缓冲液［2%(V/V)Triton X100，1%(V/V)SDS，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L TrisCl pH 8.0，1 mmol/L EDTA pH 8.0］悬浮细胞，再加200μl的玻璃珠和200μl的酚/氯仿，振荡3 min，加200μl TE混匀，13 000 r/min离心5 min，将上清加1 ml的无水乙醇沉淀，13 000 r/min离心10 min，干燥后加400μl的TE，5μl 10 mg/ml的Rnase A，37℃温育15 min，加10μl 4 M的乙酸铵、1 ml无水乙醇混匀后13 000 r/min离心10 min，去上清干燥，用100μl的TE溶出。1.5酵母完整细胞转化法将过夜培养的菌转接至50 ml YEPD中，使菌体浓度OD600为0.25，30℃振荡培养到一定菌体浓度（OD600），离心收集菌体，用无菌水洗涤，1 ml的100 mmol/L LiAc洗涤，重悬细胞于400μl的100 mmol/L LiAc中混匀。分成50μl小份离心后，依次加入240μl 50%PEG6000，36μl 1 mol/L LiAc，5μl单链鱼精DNA，70μl无菌重蒸水和质粒DNA混匀。30℃保温30 min后，42℃水浴中热激25 min。离心除去上清，重悬细胞于无菌水中，涂布相应的选择平板，30℃恒温培养3～4 d。1.6 SOD1基因中断框的构建SOD1基因中断框的构建采用Ulrich等报道的LFHPCR法，依据遗传霉素抗性基因(KanMX4)和SOD1基因上下游序列设计4条引物（序列分别为:SOD11:AGTATCTCTGAAGTGCAG;SOD12:TTACGATCCATTGACTGCAGCGTACTATAAATTAATTATGTTTTATTTG;SOD13:TAAGGCACTGATCGATATCGATGATATGTTAATGATAATATACTTG;SOD14:AATAGTGAATGATATGGAG），进行3次PCR反应，得到的两侧与SOD1基因两端侧翼序列同源、中间为KanMX4筛选标记基因的敲除片段。1.7酵母细胞生长曲线的测定将酵母菌株接种于含有40 ml YEPD培养基的100 ml三角瓶中，30℃摇床培养，转速180 r/min，定时取样，在600 nm波长处测定吸光度值，绘制细胞生长曲线。2结果2.1 SOD1:KanMX4基因中断框的构建以菌株BY5677染色体为模板，用SOD11和SOD12为引物扩增SOD1基因的上游序列，扩增产物命名为SOD1A，大小为228 bp；用SOD13和SOD14为引物扩增TRK1基因的下游序列，扩增产物命名为SOD1B，大小约231 bp（图1A）。随后以SOD1A、SOD1B为引物，以质粒pLEJ009为模板扩增含有KanMX4基因的目的片段，大小为1 967 bp（图1B）。将SOD1:KanMX4目的片段以酿酒酵母完整细胞转化法对出发菌株BY5677进行转化，以含400μg/mL G418的YEPD平板筛选转化子。2.2 SOD1Δ缺失菌株的验证挑取G418平板上的转化子，液体培养后提取染色体。分别以菌株BY5677染色体和转化子染色体作为模板，用SOD11、SOD14为引物进行PCR反应。电泳结果表明，野生型菌株和转化子分别得到大小约为933 bp和1 967 bp的目的条带(图2)，实验结果与预期相符。表明BY5677菌株中SOD1基因已成功被KanMX4基因所置换，将转化子命名为DS1。2.3 SOD1基因缺失细胞生长的影响通过酵母细胞生长曲线可以看出(图3),SOD1基因缺失后酵母细胞生长速度减缓(0～4 h),达到稳定期后也小于正常菌株的细胞浓度，表明SOD1基因在维持细胞正常生长中起到重要作用。3讨论家族性肌萎缩硬化症（FALS）是一种严重的以脑和脊髓中大的运动神经元变性为特征的神经系统变性疾病，常在病后3～5年内死亡，这种疾病广泛发生于世界各地。目前对于这种疾病尚无有效的治疗方法，自1993年Rosen等首次报道了FALS发病与位于常染色体上显性遗传的铜锌超氧化物歧化酶（SOD1）的突变密切相关以来［3］，至今已发现与FALS发病有关的SOD1突变类型多达90种以上，其中多数的突变为错义突变和缺失［7］。超氧化物歧化酶是体内活性氧清除体系中最重要的抗氧化酶之一，它能催化超氧化物阴离子自由基（O2-）歧化为过氧化氢(H2O2)与氧气,而H2O2再由过氧化氢酶催化生成水和氧气，其亦能阻止超氧化物与一氧化氮反应形成过氧化亚硝酸阴离子，从而抑制羟自由基的产生，使体内活性氧含量处于较低水平，避免引起神经元损害［8］。目前越来越多的研究表明，SOD1突变体的细胞毒性作用可能在FALS的发病中起重要作用，但对SOD1的致病机制的了解仍很少［8，9］。超氧化物歧化酶在进化上高度保守,从酵母到人类SOD1结构基本相同。酿酒酵母易培养、生活周期短，遗传背景清晰，同时以酿酒酵母为基础的分子生物学研究技术平台日趋完善，使研究方便可行，因此是研究SOD1突变体生物毒性作用的理想模式生物。本研究利用LFHPCR技术,成功构建SOD1基因缺失的酵母菌株，同时发现该基因缺失可导致酵母细胞生长缓慢。下一步计划构建与家族性肌萎缩硬化症发病有关的SOD1突变体基因，并导入SOD1基因缺失的酵母菌株，分析它们对酵母细胞的毒性作用。酵母SOD1基因缺陷菌株的成功构建，为进一步以酵母为模型开展与家族性肌萎缩硬化症发病有关的铜锌超氧化物歧化酶突变体的生物毒性奠定了基础。参考文献［1］MajoorKrakauer D,Willems PJ,Hofman A.Genetic epidemiology of amyotrophic lateral sclerosis［J］.Clin Genet,2003,63(2):83101.［2］冯善伟.家族性肌萎缩硬化症的分子遗传学研究进展［J］.国外医学神经病学神经外科学分册,2003,30(6)：529532.［3］Rosen DR,Siddique T,Patterson D,et al.Mutation site of Cu/Zn superoxide dismutase in an amyotrophic lateral sclerosis family amyotrophic lateral sclerosis［J］.Nature,1993,362(6415):5962.［4］Tamai KT,Gralla EB,Ellerby LM,et al.Yeast and mammalian metallothioneins functionally substitute for yeast copperzinc superoxide dismutase［J］.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90(17):80138017.［5］Steinmetz LM,Scharfe C,Deutschbauer AM,et al.Systematic screen for human disease genes in yeast［J］.Nat Genet,2002,31(4):400404.［6］谭永林,徐冬斌,张达力,等.酵母降胆固醇药物筛选模型的建立与应用［J］.复旦学报，2005,44(4):490497.［7］Jacobson J,Jonsson PA,Andersen PM,et al.Superoxide dismutase in CSF from amyotrophic lateral sclerosis patients with and without CuZn superoxide dismutase mutations［J］.Brain,2001,124：14611466．［8］Nagai M,Re DB,Nagata T,et al.Astrocytes expressing ALSlinked mutated SOD1 release factors selectively toxic to motor neurons［J］.Nat Neurosci,2007,10(5)：615622.［9］沈涛，张天乐，刘长林.铜锌超氧化物歧化酶的突变与神经退行性紊乱的生物无机化学［J］.化学进展，2004,16(5)：813819.