家兔血浆中龙胆苦苷浓度的高效液相色谱测定药学论文.doc

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家兔血浆中龙胆苦苷浓度的高效液相色谱测定_药学论文作者：赵淑红，蒋袁絮，马学琴，高亦珑，杨光，李记诤，马琳，余建强【摘要】目的建立家兔血浆中龙胆苦苷的HPLC检测方法,研究秦艽中龙胆苦苷在家兔体内的药代动力学规律。方法以秦艽水煎醇沉液家兔耳静脉注射后定时取血,色谱条件:SHIM-PACK VP-ODS色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm);流动相:甲醇-乙腈-水（5∶10∶85）;检测波长:271 nm;流速:1.0 ml·min-1，测定血浆药物浓度，采用DAS软件计算药动血参数。结果龙胆苦苷血药浓度在0.683～136.6μg·ml-1范围内线性关系良好(r=0.999 5),最低定量浓度为0.0342μg·ml-1。日内、日间精密度均小于10﹪,回收率为89.8﹪～101.4.3﹪。药-时曲线符合三房室模型，主要药动学参数：Tmax=0.083 h，Cmax=45.1 mg·L-1，V=1.312L·kg-1，CL=0.761 L·h-1·kg-1，t1/2=1.195 h,AUC(0～∞)=30.78 mg·L-1·h-1。结论该方法具有准确、简便、快速的特点,可用于秦艽中龙胆苦苷的检测。【关键词】龙胆苦苷；高效液相色谱法；血药浓度；药动学秦艽作为一种常用的传统中药,野生品种早已不能满足临床需要，栽培秦艽开发利用尚处于起步阶段，对其的研究多见于化学成分及药效学方面，少有对药动学的研究。有报道龙胆苦苷在Beagle犬体内的药动学过程表现为静脉内给药一房室模型［1］;大鼠灌胃给予含龙胆苦苷药物后［2］；用HPLC法测定龙胆苦苷呈静脉外给药的二房室模型。龙胆苦苷是裂环烯醚萜苷类化合物，极性大，吸收较少，静脉外给药其血药浓度均较低。为此本实验选择兔耳静脉注射秦艽水煎醇沉液，用HPLC法定量测定家兔体内龙胆苦苷的药动学过程。1材料与仪器1.1药品三年生栽培秦艽采于宁夏六盘山药材栽培基地(由宁夏六盘山药材栽培基地张守宗高级农艺师提供)，经宁夏药检所邢世瑞主任药师鉴定原植物为秦艽Gentiana macrophylla Pall.的生药材；按中药制剂药理学实验的常规制备方法制备秦艽水煎醇沉液1.0 g/ml（以生药计），于冰箱内冷藏保存。1.2试剂与药物龙胆苦苷对照品（中国药品生物制品检测定所，批号：770-200105）。乙腈、甲醇（美国TEDIA，色谱纯），水为去离子水，其余试剂均为分析纯。1.3仪器日本岛津LC-20A系列高效液相色谱仪(包括LC-20AT输液泵、DGU-20A5在线、脱气机、SPD-20AV紫外检测器、SCL-20Avp系统控制器、LC-solution色谱工作站)。Explorer电子分析天平(Ohaus Corporation，美国)；UV-2550型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。1.4动物家兔1.5～2.5 kg，普通级,由宁夏医科大学实验动物中心提供。2方法与结果2.1色谱条件色谱柱为SHIM-PACK VP-ODS（150 mm×4.6 mm,5μm）;流动相为甲醇-乙腈-水（5∶10∶85）；检测波长271 nm；流速1.0 ml·min-1。2.2系列对照品溶液的配制精密称取龙胆苦苷对照品0.006 83 g至5 ml容量瓶中,甲醇溶解，定容至刻度,得浓度为1.366 mg·ml-1标准贮备液，分别稀释成6种不同浓度的系列对照品溶液，密封、低温、避光保存备用。2.3血清样品的预处理微量移液器吸取经预处理的兔血清200μl于2 ml离心管中，加600μl甲醇沉淀蛋白，于涡旋混合器上充分混合30 s，离心（16 000 r·min-1）10 min，取上清液，经0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液10μl进样得色谱图1。空白血清在5 min之前有色谱峰，5 min后再无色谱峰出现。在相同的HPLC流动相条件下，与龙胆苦苷对照品的保留时间相比较，确认龙胆苦苷样品，在上述色谱条件下分离良好，空白血浆内源性物质无干扰。2.4 HPLC法测定秦艽中龙胆苦苷血药浓度2.4.1对照品标准曲线制作取空白血清，加入标准品的血清溶液，配置成6种所需不同浓度的系列标准血清样品，依照“血清预处理”项下操作后测定峰面积，以龙胆苦苷的浓度为横坐标，以测得的相应峰面积为纵坐标，用最小二乘法进行线性回归。得回归方程A＝7922.7C＋456.52，R2＝0.9995，线性范围0.683～136.6μg·ml-1，最低定量浓度为0.034 2μg·ml-1。见图2。2.4.2回收率实验精密移取200μl空白血清，加入标准品的血清溶液，配制成高、中、低浓度3组各5份，照“2.3”项下操作,计算平均方法回收率。结果见表1。表1龙胆苦苷回收率实验数据（略）2.4.3精密度实验取空白血清，加入标准品的血清溶液，按“回收率实验”项下配制不同浓度空白血清样品各5份，分别测定计算各浓度日内精密度，并连续测定5 d，计算日间精密度。结果见表2。表2龙胆苦苷精密度实验数据（略）2.5给药及血液采集取健康家兔6只，秦艽水煎醇提液按2ml/kg耳静脉注射给药。给药前取空白血清，给药后分别在0.08，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，4，6，8 h经耳中动脉取血，约1 ml/次，置于具塞离心管中，静置10 min后，以3 000 r/min离心10 min，分离血清，在低温冰箱冷冻保存至测试时。2.6样品测试从冰箱中取出待测血清样品，室温下自然解冻，血样经乙腈预处理后,进行HPLC分析,色谱条件同“2.1”项。精密量取给药后血清200μl于2 ml离心管中，按样品测定方法和预处理方法分别测定各时间点的血药浓度。结果见图1。2.7数据处理与分析依据标准工作曲线，计算家兔血清中龙胆苦苷的血药浓度，见图2。采用DAS软件自动拟合得到有关的药代动力学参数，龙胆苦苷的分布代谢最佳房室模型为三房室模型，主要药代动力学参数Tmax=0.083 h，Cmax=45.1 mg/L，V=1.312 L/kg，CL=0.761 L·h-1·kg-1，t1/2=1.195 h,AUC(0～∞)=30.78 mg·L-1·h-1。3讨论随着对秦艽药用价值的研究逐步深入,对秦艽成品药的开发也即将进入生产阶段，研究秦艽制剂的体内过程，对秦艽成品药的开发有一定的参考价值。兔耳静脉注射秦艽水煎醇沉液，进行单剂量药动学研究，其Cmax达到45.1 mg/L,能准确的用HPLC进行定量测定。此方法准确、简便、快速,可用于秦艽中龙胆苦苷的微量检测。用DAS2.0软件处理显示龙胆苦苷的分布代谢最佳房室模型为三房室模型，说明龙胆苦苷在体内能维持较长时间稳定的治疗浓度。【参考文献】［1］冯英菊，杨甫昭，郭五保，等.龙胆苦苷在beage犬体内药代动力学研究［J］.中药新药与临床药理，2004，15（5）：333.［2］姜少灏,康丽娟,蒋晔，等.龙胆及其复方中龙胆苦苷在大鼠体内的药动学研究［J］.中国药学杂志，2005，40（3）：212.