厌氧培养方法.doc

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厌氧性细菌的分离培养法厌氧菌需有较低的氧化—还原势能才能生长(例如破伤风梭状芽孢杆菌需氧化—还原电势降低至0.11V时才开始生长)，在有氧的环境下，培养基的氧化—还原电势较高，不适于厌氧菌的生长。为使培养基降低势，降低培养环境的氧压是十分必要的。现有的厌氧培养法甚多，主要有生物学，化学和物理学3种方法，可根据各实验室的具体情况而选用。1．生物学方法培养基中含有植物组织(如马铃薯、燕麦、发芽谷物等)或动物组织(新鲜无菌的小片组织或加热杀菌的肌肉、心、脑等)，由于组织的呼吸作用或组织中的可氧化物质氧化而消耗氧气(如肌肉或脑组织中不饱和脂肪酸的氧化能消耗氧气，碎肉培养基的应用，就是根据这个原理)，组织中所含的还原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化—还原电势下降。另外，将厌氧菌与需氧菌共同培养在一个平皿内，利用需氧菌的生长将氧消耗后，使厌氧菌能生长。其方法是将培养皿的一半接种吸收氧气能力强的需氧菌(如枯草杆菌)，另一半接种厌氧菌，接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上，并用石蜡密封，置37恒温箱中培养2~3d后，即可观察到需氧菌和厌氧菌均先后生长。2．化学方法利用还原作用强的化学物质，将环境或培养基内的氧气吸收，或用还原氧化型物质，降低氧化—还原电势。（１）李伏夫(B．M．JIbbob)法此法系用连二亚硫酸纳(Sodium hydrosulphite)和碳酸钠以吸收空气中的氧气，其反应式如下：Na2S204十Na2C03十O2一→Na2SO4十Na2SO3十C02取一有盖的玻璃罐，罐底垫一薄层棉花，将接种好的平皿重叠正放于罐内(如系液体培养基，则直立于罐内)，最上端保留可容纳1~2个平皿的空间(视玻罐的体积而定)，按玻罐的体积每1000cm3空间用连二亚硫酸纳及碳酸钠各30g，在纸上混匀后，盛于上面的空平皿中，加水少许使混合物潮湿，但不可过湿，以免罐内水分过多。若用无盖玻罐，则可将平皿重叠正放在浅底容器上，以无盖玻罐罩于皿上，罐口周围用胶泥或水银封闭(如图１－５)。（２）焦性没食子酸法焦性没食子酸在碱性溶液中能吸收大重氧气，同时由淡棕变为深棕色的焦性没食橙(Purpurgallin)。每l00cm3空间用焦性没食子酸1g及10％氢氧化纳或氢氧化钾l0ml，其具体方法主要有下列几种：1）单个培养皿法：将厌氧菌接种于血琼脂平板。取方形玻璃板一块，中央置纱布或棉花或重叠滤纸一片，在其上放焦性没食子酸0.2g及10％NaOH溶液0.5mL。迅速拿去皿盖，将培养皿倒置于其上，周围以融化石蜡或胶泥密封。将此玻璃板连同培养皿放人37C温箱培养24~48h后，取出观察。2）Buchner氏试管法：取一大试管，在管底放焦性没食子酸0.5g及玻璃珠数个或放一螺旋状铅丝。将已接种的培养管放人大试管中，迅速加入20％NaOH溶液0.5ml，立即将管口用橡皮塞塞紧，必要时周围封以石蜡，37培养24~48h后观察(图１－６)。３）玻罐或干燥器法：置适量焦性没食子酸于一干燥器或玻罐的隔板下面，将培养皿或试管置于隔板上，并在玻罐内置美蓝指示剂一管，从罐侧加入氢氧化钠溶液放于罐底，将焦性没食子酸用纸或纱布包好，用线系住，暂勿与氢氧化钠接触，待一切准备好后．将线放下，使焦性没食子酸落人氢氧化纳溶液中，立即将盖盖好；封紧，置温箱中培养。４）瑞(Wright)氏法：将已接种细菌的培养管的脱脂棉塞在火焰中烧灼灭菌后，塞人管中离培养基1~1．5cm处，置适量焦性没食子酸于其上，加入10％NaOH溶液2ml，迅速用橡皮塞将管口塞紧，以胶泥或石蜡严密封闭置温箱中培养(图１－７)。５）史(Spray)氏法：用图１－８所示的厌氧培养皿，在皿底一边置焦性没食子酸，另一边置氢氧化钠溶液，将已接种的平皿翻盖于皿上，并将接合处用胶泥或石蜡密封完全，然后摇动底部，使氢氧化钠溶液与焦性没食子酸混合，置温箱中培养。６）平皿法：置一片中有小圆孔的金属板于两平皿之间，上面的平皿接种细菌，下面的平皿盛焦性没食子酸及氢氧化钠溶液，用胶泥封固后，置温箱中培养（图１－９）。７）硫乙醇酸钠法硫乙醇酸钠(HSCH2COONa)是一种还原剂，加入培养基中，能除去其中的氧或还原性物质，促使厌氧菌生长。其他可用的还原剂包括葡萄糖、维生素C、半胱氨酸等。A．液体培养基法：将细菌种人含0.1％的硫乙醇酸钠液体培养基中，37℃培养24~48h后观察，本培养基中加美蓝液作为氧化还原的指示剂，在无氧条件下，美蓝被还原成无色。Ｂ．固体培养基法：常采用特殊构造的Brewer培养皿，可使厌氧菌在培养基表面生长而形成孤立的菌落；操作过程是先将Brewer氏皿干热灭菌，将溶化且冷却至50℃左右的硫乙醇酸钠固体培养基倾人皿内。待琼脂冷凝后，将厌氧菌接种于培养基的中央部分。盖上皿盖，使皿盖内缘与培养基外围部分相互紧密接触（图１－10)。此时皿盖与培养基中央部分留在空隙间的少量氧气可被培养基中的硫乙醇酸钠还原，故美蓝应逐渐褪色，而外缘部分，因与大气相通，故仍呈蓝色。将Brewer氏培养皿置于37℃恒温箱内，经过24~48h后观察。3．物理学方法利用加热、密封、抽气等物理学方法，以驱除或隔绝环境及培养基中的氧气，使其形成厌氧状态，有利于厌氧菌的生长发育。（１）厌氧罐法常用的厌氧罐有Brewer氏罐，Broen氏罐和Mclntosh-Fildes二氏罐（图１－11）。将接种好的厌氧菌培养皿依次放于厌氧罐中，先抽去部分空气，代以氢气至大气压。通电，使罐中残存的氧与氢经铂或钯的催化而化合成水，使罐内氧气全部消失。将整个厌氧罐放人孵育箱培养。本法适用大量的厌氧菌培养。（２）真空干燥器法将欲培养的平皿或试管放人真空干燥器中，开动抽气机，抽至高度真空后，替代以氢、氮或二氧化碳气体。将整个干燥器放进孵育箱培养。（３）高层琼脂法加热融化高层琼脂，冷至45℃左右接种厌氧菌，迅速混合均匀。冷凝后37℃培养，厌氧菌在近管底处生长。（４）加热密封法将液体培养基放在阿诺氏蒸锅内加热l0min，驱除溶解于液体中的空气，取出，迅速置于冷水中冷却。接种厌氧菌后，在培养基液面覆盖一层约0.5cm的无菌凡士林石蜡，置37℃培养。此外，尚有摇振培养法，此处从略。（５）二氧化碳培养法少数细菌如布氏杆菌(牛型)等，孵育时，需大气中添加5％~10％二氧化碳，方能使之生长繁殖旺盛。常用的方法是置于CO2培养箱中进行培养；最简单的二氧化碳培养法是在盛放培养物的有盖玻璃缸内，燃点蜡烛，当火焰熄灭时，该缸的大气中，就约增加了5％~10％的二氧化碳。也可用化学物质作用后生成二氧化碳，如碳酸氢钠与硫酸钠或碳酸氢钠与硫酸作用即可生成二氧化碳。若各用0.4％NaHCO3与30％H2SO4lmL，则可产生22.4mL的二氧化碳气体。