【产漆酶真菌以及漆酶的研究】.doc

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产漆酶真菌以及漆酶的研究摘要：漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，在细菌、真菌、放线菌、植物中都有报道，但报道最多的为真菌，尤其是白腐真菌。漆酶能够降解环境中的木质素，在纸浆漂白、废水处理中意义重大。漆酶通常情况下漆酶含有4个铜原子结合位点，通过电子在这四个铜原子间相互传递达到分解底物的目的。漆酶基因的异源表达已经吸引了广大学者的目光，至今为止，数十种真菌的漆酶基因已经成功在酵母等异源表达系统中表达，我们可以预见漆酶在人类未来的生活中将发挥重要作用。关键词：漆酶，白腐真菌，铜原子结合，异源表达现如今，环境污染已严重影响了人类的生存，造纸厂、纺织厂排出的废水则是重要的污染源之一。木质素是使废水颜色发黑的主要原因[1]，倘若在工厂排出废水前先将木质素出去，将会大大降低废水的毒性。木质素是由聚合的芳香醇构成的一类物质，存在于木质组织中，是世界上仅次于纤维素的第二位最丰富的有机物。木质素作为纤维素的粘合剂，能增强植物体的机械强度，利于输导组织的水分运输和抵抗不良外界环境的侵袭。木质素外观上是一种白色或接近无色的物质，相对密度大约在1.35~1.50之间，非常坚硬，难溶于各种无机或有机溶剂[2]。木质素属天然芳香族高分子聚合物，是一类在自然界存在量很大但是又较难降解的可再生资源，木质素不含易水解的重复单元，因而不受水解酶的攻击，不仅如此，它还和半纤维素以共价键形式结合，将纤维素分子包埋在其中，形成一种天然屏障，使纤维素酶不易与纤维素分子接触，给纤维素的降解也造成了困难[3]。因此去木质素成为目前人们面临的一大难题。1白腐真菌降解木质素研究表明，在自然界中，木质素的完全降解是真菌、细菌、放线菌及相应微生物群落共同作用的结果。其中，真菌起主导作用[4]，某些真菌能够有效的降解木质素，尤其是白腐真菌（white-rot fungus）可通过一系列的酶促反应实现对木质素的彻底降解。白腐真菌是一类丝状真菌，分类学上属于真菌门，绝大多数为担子菌纲，少数为子囊菌纲。目前，研究最多的是黄孢原毛平革菌、彩绒草盖菌、变色栓菌、射脉菌、凤尾菇等。其中，黄孢原毛平革菌是典型菌种，是研究木质素降解的模式菌，普遍分布于北美，我国尚未发现。白腐真菌木质素酶系统包括两类三种[4]，一类是是能利用H2O2作电子受体的过氧化物酶类，这类酶包括木质素过氧化物酶(EC 1.11.1.13 Lignin Peroxidase,简称Lip)和锰依赖过氧化物酶(EC1.11.1.14 Manganese Peroxidase,简称MnP)；另一类是利用O2作为电子受体的多酚氧化酶类，这类酶称为漆酶(EC 1.10.3.2 laccase,简称Lac)。以上三种酶各自代表一系列同工酶。木质素过氧化物酶和锰依赖过氧化物酶都是含亚铁血红素的糖蛋白，木质素过氧化物酶分子量大约为40 kD，锰依赖过氧化物酶的分子量一般在38~62.5 kD之间，它们的血红素辅基埋在蛋白质内构成活性中心(锰依赖过氧化物酶的活性中心尚需一个Mn2+和两个起稳定结构作用的Ca2+)；漆酶则是一种以O2作电子受体的含有4个铜离子的氧化酶，分子量在60~80 kD之间。2漆酶催化氧化底物的基理漆酶最早由一名日本人发现，它并非只存在于微生物界，在细菌、植物中也有报道[5]。漆酶是一种含铜的多酚氧化酶[6]，属于蓝色多铜氧化酶家族，能够氧化多种芳香化合物和其它有机化合物，且副产物只有水，被誉为“绿色酶”。漆酶一般以单体存在，极少情况下会有同源或异源二聚体，以及同源四聚体。通常情况下漆酶含有4个铜原子结合位点，根据其光谱和磁性特征可将其分为三类，Ⅰ型Cu2+一个，呈蓝色，在紫外可见光谱614 nm处有特征吸收，Ⅱ型Cu2+一个，非蓝色，没有特征吸收光谱，Ⅲ型Cu24+两个，是耦合的离子对，在紫外可见光谱330 nm处有较宽的吸收带。在三类铜原子中，前两种是单电子受体，顺磁性，可用顺磁共振测定，Ⅲ型Cu24+是反磁性，无法用顺次共振检测。Ⅰ型Cu2+中心相对独立，并且都与两个组氨酸（His）的N和一个半胱氨酸（Cys）的S配位，形成扭曲的四面体结构，其中共价键Cu-S（Cys）的配位使漆酶呈现蓝色。Ⅱ型Cu2+和Ⅲ型Cu24+中心紧密相连形成一个三核铜簇。三核铜簇与8个His配位结合，其中Ⅱ型铜结合2个His，Ⅲ型铜结合6个His。当然，并不是所有的漆酶都具有四个铜原子。Ⅰ型Cu2+Ⅱ型Cu2+和Ⅲ型Cu24+漆酶催化底物氧化时[7]，Ⅰ型Cu2+和Ⅱ型Cu2+首先分别从底物接受一个电子，由二价变为一价，然后通过分子内的电子转移，Ⅰ型Cu2+和Ⅱ型Cu2+将电子传递给Ⅲ型Cu24+，它们由一价变成二价，Ⅲ型Cu24+由二价变成一价。当Ⅰ型Cu2+和Ⅱ型Cu2+分别再次从底物接受一个电子变成一价时，四个铜离子都是一价，这时漆酶呈还原态。在有O2存在下，还原态漆酶被氧化。O2从Ⅰ型Cu+和Ⅲ型Cu22+迅速接受三个电子，生成光活性氧中间体(Cu2O)3+，并失去一分子水，Ⅰ型Cu+和Ⅲ型Cu22+由一价变成二价。Ⅱ型Cu+再氧化很慢，氧中间体一直与Ⅲ型Cu22+相连，当它从Ⅱ型Cu+接受第四个电子还原为水时才脱离Ⅲ型Cu24+，这时四个铜离子都是二价，漆酶呈氧化态。这样，通过四个铜离子的协同作用，传递电子，同时发生价态变化，实现漆酶对底物的催化氧化。3漆酶的异源表达虽然漆酶的潜在应用价值很广[8]，比如在纸张漂白、生物修复、染料脱色、果汁与酒的澄清和纺织品的清洁等，但是由于产量低，价格昂贵，漆酶的工业应用受到很大的限制。漆酶属于真菌的第二产物，仅在外界环境恶劣的情况下才会诱导产生，因此仅凭野生菌生产的漆酶远远无法满足需求。异源表达漆酶基因是个有效的办法，目前已有多种蛋白通过异源表达的方法投入工业生产，比如青霉素、蔗糖酶、几种生长激素等。漆酶异源表达的前提是将其基因克隆出来[9][10]，1988年Frohman等首次利用快速扩增cDNA技术从白腐菌P.ostreatus中克隆到漆酶poxI基因，后来的学者多用RT-PCR技术来获得漆酶基因；也有学者先建立菌种的cDNA文库，然后以已知的漆酶基因做探针进行筛选；还有人利用漆酶铜原子结合位点的保守性，设计引物克隆漆酶基因。到现在，30种不同来源的漆酶基因已被克隆和测序。酵母表达系统是目前研究的较为透彻的表达系统，它易于进行分子遗传操作，能够对重组蛋白进行翻译后的加工修饰和分泌表达，具备完善的发酵方法，重组蛋白表达量高，自身满足安全需要，已成功生产了多种重组蛋白。酵母也成为重组漆酶的主要表达宿主，Trametes sanguinea、Trametes versicolor、Melanocarpus Albomyces、M.thermophila、Pleurotus ostreatus、Trametes Versicolor等产漆酶的菌株的重组基因均被报道在酵母S.cerevisiae中表达。外源漆酶基因在酵母中表达会受很多因素影响，如启动子、信号肽、漆酶基因、表达菌株型号和发酵条件等。有报道表明在S.cerevisiae中表达漆酶时采用诱导型启动子比组成型启动子能获得更高的表达量，采用α因子信号肽一般比漆酶本地信号肽得到更好的表达效果；另外，发酵方式、温度、pH值等对表达影响很大。其次，丝状真菌表达系统是另一种用于生产重组蛋白质产品的工具，其优势在于其具有分泌大量胞外蛋白质的能力。目前，真菌漆酶已在黑曲霉(A.niger)、构巢曲霉(A.nidulans)、米曲霉(A.oryzae)、里氏木霉(T.reesei)中进行了异源表达的研究，最高表达量可达7000 U/L。但与酵母表达系统相比，酶活相对较低，为了提高漆酶的表达量，研究者对丝状真菌表达系统进行了改进，比如选择来源于丝状真菌自身的强启动子构建表达载体，通过构建融合蛋白提高漆酶的分泌水平，或抑制丝状真菌自身的蛋白酶系统，以降低对异源漆酶蛋白的水解等等。4结论生物降解木质素是一种趋势，利用生物方法漂白纸浆、处理废水、去除木质素不仅污染小，而且使用效率高，能耗低，虽然其效率受诸多因素的影响，随着科技的发展，人类对木质素降解机制的认识越来越清楚，我们有理由相信，漆酶的研究和应用将取得重大进步。参考文献[1]Deepak Pant AE Alok Adholeya.Concentration of fungal ligninolytic enzymes by ultrafiltration and their use in distillery effluent decolorization[J].World J Microbiol Biotechnol,2009,25:1793–1800.[2]王红.论白腐真菌产木质素降解酶在环境治理中的应用[J].现代商贸工业,2009,7:297-298.[3]王华,刘小刚,罗华,杨光.木质素降解菌筛选及葡萄枝条木质素降解研究[J].西北农业学报,2009,18(5):302-305.[4]张力,韩大勇.白腐真菌木质素降解酶系研究进展[J].中国牧业通讯，2008，23：6-8.[5]曾涛,陈汉清,曾会.木质素酶及其生产菌的筛选育种[J].基因组学与应用生物学，2009,28(3),578-582.[6]宋安东,王艳婕,王松江,戚元成,吴坤.漆酶的分子生物学研究及其应用[J].信阳师范学院学报,2004,17(2):244-248.[7]胡平平,付时雨.漆酶催化活性中心结构及其特性研究进展[J].林产化学与工业,2001，21（3）:69-75.[8]季立才,胡培植.漆酶催化氧化反应研究进展[J].林产化学与工业,1997,17(1):79-84.[6]李阳,蒋国翔,牛军峰,王颖,呼丽娟.漆酶催化氧化水中有机污染物.化学进展,2009,21(10):2028-2036.[9]左斌,王海斌,葛俊.真菌漆酶基因研究进展.微生物学免疫学进展,2009,37(1):72-76.[10]刘志明,郭丽琼,林俊芳.真菌漆酶异源表达研究进展[J].中国生物工程杂志,2009,29(6):135-142.