Marfan综合征FBN1基因新的剪接位点的置换突变医学论文.doc

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Marfan综合征FBN1基因新的剪接位点的置换突变_医学论文作者：伍严安,陈喜军,黄肖利,陈同,陈发文,陈发林,黄毅【关键词】马凡综合征;,原纤维蛋白摘要:目的对Marfan综合征(MFS)患者的原纤维蛋白1基因(FBN1)进行突变筛查,探讨MFS患者新的FBN1突变。方法应用聚合酶链反应(PCR)和变性高效液相色谱法(DHPLC)对1例MFS患者FBN1的65个外显子进行突变筛查,对DHPLC图形异常的PCR扩增片段用DNA测序鉴定突变位点及性质。用限制性片段长度多态性分析法(RFLP)进一步证实突变。结果发现1种新的FBN1剪接位点的置换突变(Intron29+4A>T)。结论FBN1的Intron29+4A>T可能为该MFS患者的发病原因。关键词:马凡综合征;原纤维蛋白1;基因;突变;色谱法，高效液相；多态性，限制性片段长度马凡综合征(Marfan syndrome,MFS)是一种常染色体显性遗传性结缔组织病,发病率为1/(5 000~10 000),25%~30%患者为散发病例。MFS主要累及心血管、骨骼和眼等系统或器官,临床表现有夹层主动脉瘤、二尖瓣脱垂、蜘蛛脚样指趾、晶状体异位等。MFS还可累及肺、皮肤和中枢神经系统等器官或系统,临床表现有自发性气胸、皮肤不能解释的牵拉体征和腰骶部硬脊膜的扩张等。原纤维蛋白1(fibrillin1)基因(FBN1)全长约235 kb,由65个外显子构成,定位于15q21.1。其mRNA包含9 749个核苷酸。自1991年Dietz等提出FBN1突变是MFS的致病原因以来,发现的FBN1突变有601种,分布于整个FBN1。原纤维蛋白1为相对分子质量320 kD的糖蛋白,由2 871个氨基酸组成,是构成细胞外微纤维(直径10~12 nm)的主要蛋白之一。因此FBN1突变将影响微纤维的结构与功能[12]。近几年发现另1种与MFS有关的基因――转化生长因子β受体2(transforming growth factor beta receptor typeⅡ,TGFBR2)基因[3]。笔者采用聚合酶链反应(PCR)、变性高效液相色谱(denaturing highperformance liquid chromatography,DHPLC)异源双链分析与DNA测序等方法,对1例MFS患者进行FBN1突变筛查与鉴定,探讨新的FBN1突变。1对象与方法1.1对象先证者,女,12岁,以“突发心悸、胸闷半天”于2003年11月入福建省立医院心外科。患者身高170 cm,肢展173 cm,体质量37 kg,有蜘蛛样指征。心脏二维彩超示主动脉窦部增宽,主动脉瓣呈二叶启闭及返流（＋）,二尖瓣脱垂;有晶状体异位和高度近视，临床诊断为MFS。该患者有家族史,其母有身材瘦高,双眼白内障和晶状体异位等MFS临床表现。其父临床表型正常。50名无关正常人为对照组。1.2方法1.2.1基因组DNA抽提取患者静脉血2 mL,EDTA抗凝,用全血DNA抽提试剂盒(德国Qiagen公司)抽提基因组DNA。1.2.2聚合酶链反应(PCR)对FBN1的65个外显子进行PCR扩增。引物由美国Johns Hopkins大学医学院Dietz教授惠赠。引物分别位于外显子两侧的内含子区域。其中第29外显子正向:5’CAGACATCCAAACCATATCAG3’反向:5’GAACCTACTGAGAGATTCAAC3’PCR反应体系50μL,含0.2 mmol/L dNTP,1.5 mmol/L Mg2+,DNA模板200 ng,Ex Taq DNA聚合酶(日本TaKaRa公司)1.25 U,0.4μmol/L引物。用基因扩增仪(Hema 240,珠海黑马医学仪器公司)进行PCR反应。反应条件:95℃5 min,95℃30 s→55~61℃30 s→72℃50 s,共30个循环;72℃最后延伸10 min[34]。PCR产物用含0.5μg/mL溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。1.2.3 DHPLC筛选FBN1突变用DHPLC系统(美国Transgenomic公司)对PCR反应产物进行筛选突变分析[5]。1.2.4 DNA测序用全自动测序仪(ABI 377型,美国Applied Biosystems公司)对DHPLC图形异常的PCR产物进行DNA序列测定。1.2.5限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism,RELP)用RFLP进一步鉴定FBN1的Intron29+4A>T。第29内含子PCR扩增引物参照文献[6]设计,正向:5’GACTCAAGCCTGCTTGACTCC3’反向:5’GCCCTGCCTCTTAAATAGTG3’扩增片段326 bp。限制性内切酶为Oli I,切点:5’CACNNNNGTG3’;3’GTGNNNNCAC5’,酶切反应时间16 h。第29内含子野生型的PCR产物不能发生酶切反应。如果存在Intron29+4A>T,能够发生酶切反应,并形成93 bp和233 bp两个片段(图1)。黑体部分为引物,下划线处为突变点,斜体为外显子部分。:切点.图1 FBN1第29内含子野生型扩增片段序列（略）Fig 1 Sequence of amplification fragment for intron 29 of FBN1 2结果2.1 DHPLC图形分析对照组及患者父亲的FBN1第29外显子PCR扩增产物在DHPLC上显示单峰,但患者及其母呈现低矮、宽大的双峰图形(图2)。P:先证者;M:先证者母亲;F:先证者父亲;N:正常人.图2 FBN1第29外显子DHPLC图（略）Fig 2 DHPLC chromatogram for exon 29 of FBN1 2.2 DNA测序FBN1第29外显子PCR扩增产物为预期的214 bp。测序显示患者与其母的FBN1有Intron29+4A>T。其父第29外显子显示正常序列(图3)。重复扩增并进行DNA测序,结果相同。2.3 RFLP FBN1第29内含子PCR产物用Oli I限制性内切酶切后电泳显示,患者与其母为两条带,片断长度为326 bp与233 bp,对照组和患者父亲为单一条带,长度为326 bp(图4)。↓:Intron29+4位置.P:先证者;M:先证者母亲;F:先证者父亲.图3 FBN1第29外显子测序结果（略）Fig 3 DNA sequencing results of the PCR products for exon 29 of FBN1 Ma:100 bp DNA marker;F:先证者父亲;M:先证者母亲;P:先证者,N:正常人.图4 FBN1第29内含子PCR产物RFLP电泳图（略）Fig 4 RFLP electrophoretogram of the PCR products for intron 29 of FBN1 3讨论3.1关于FBN1剪接位点的突变目前已报道的FBN1突变包含了置换、缺失、插入、重复等碱基变化,导致错义突变、移码突变、无义突变与剪接位点突变等多种形式突变。这些突变均能引起MFS。近年报道FBN1剪接位点的突变导致MFS的占13%~16%,突变位置为内含子的7~+5[79]。内含子中的剪接位点对于转录后形成有功能的mRNA至关重要,其突变是造成遗传病的一个重要原因。本文报道的FBN1第29内含子单碱基的置换(Intron29+4A>T)位于Intron29和Exon29的剪接位点。DNA测序及RFLP证实该家族内2例患者有相同突变,而未患病者和50名正常人显示正常结果,高度提示该突变(Intron29,+4A>T)可能是该MFS家族患病的原因。经UMD数据库(http://www.umd.be:2030//)检索,尚未见相同报道。3.2关于用DHPLC筛查FBN1突变DHPLC异源双链分析法是近年来才发展起来的一项新的基因突变筛查技术[10]。与其他相关技术相比,该方法具有灵敏度高、特异性强、自动化程度高和成本低廉等优点。笔者用PCRDHPLC筛查,对DHPLC图形异常的标本再进行DNA测序的方法,检测MFS患者的FBN1突变,取得满意效果。PCRDHPLCDNA测序有望成为检测FBN1基因突变的常用方法。(鸣谢:引物由美国Johns Hopkins大学医学院Dietz教授惠赠,特致谢意!)参考文献：[1]CollodBeroud G,LeBourdelles S,Ades L,et al.Update of the UMDFBN1 mutation database and creation of an FBN1 polymorphism database[J].Hum Mutat,2003,22(3):199208.[2]Robinson P N,Booms P,Katzke S,et al.Mutations of FBN1 and genotypephenotype correlations in Marfan syndrome and related fibrillinopathies[J].Hum Mutat,2002,20(3):153161.[3]Mizuguchi T,CollodBeroud G,Akiyama T,et al.Heterozygous TGFBR2 mutations in Marfan syndrome[J].Nat Genet,2004,36(8):855860.[4]黄肖利,伍严安,陈发林,等.马凡综合征两种新的原纤维蛋白1基因突变[J].中华医学遗传学杂志,2004,21(6):562565.[5]Matyas G,DePaepe A,Halliday D,et al.Evaluation and application of denaturing HPLC for mutation detection in Marfan syndrome:Identification of 20 novel mutations and two novel polymorphisms in the FBN1 gene[J].Hum Mutat,2002,19(4):443456.[6]Korkko J,Kaitila I,Lonnqvist L,et al.Sensitivity of conformation sensitive gel electrophoresis in detecting mutations in Marfan syndrome and related conditions[J].J Med Genet,2002,39(1):3441.[7]Biggin A,Holman K,Brett M,et al.Detection of thirty novel FBN1 mutations in patients with Marfan syndrome or a related fribrillinopathy[J].Hum Mutat,2004,23(1):99.[8]Rommel K,Karck M,Haverich A,et al.Identification of 29 novel and nine recurrent fibrillin1(FBN1)mutations and genotypephenotype correlations in 76 patients with Marfan syndrome[J].Hum Mutat,2005,26(6):529539.[9]Arbustini E,Grasso M,Ansaldi S,et al.Identification of sixtytwo novel and twelve known FBN1 mutations in eightyone unrelated probands with Marfan syndrome and other fibrillinopathies[J].Hum Mutat,2005,26(5):494.[10]Xiao W Z,Cefner P J.Denaturing highperformance liquid chromatography:a review[J].Hum Mutat,2001,17(6):439474.