人补体C3功能片段rC3B的克隆、表达和活性鉴定医学论文.doc

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人补体C3功能片段rC3B的克隆、表达和活性鉴定_医学论文作者：甘慧，周勇，孙萍，朱晓霞，王全立，詹林盛【摘要】本研究获取人类补体C3上与补体Ⅲ型受体(CR3)结合的功能区rC3B，并进行了表达、纯化和活性鉴定。用基因扩增法获得rC3B基因，并插入原核表达载体pQE30a，转化大肠杆菌E.coli M15进行表达；用SDSPAGE电泳检验目的蛋白后以Ni2+螯合Sepharose Fast Flow层析进行纯化；用Western blot与单核细胞黏附试验初步确认蛋白活性。结果表明：钓取了人类补体C3的功能片段rC3B，构建了原核表达载体pQE30rC3B并在E.coli中得了到高效表达；经Ni2+固相化的螯合Sepharose Fast Flow亲和层析纯化蛋白后，蛋白纯度达80％；Western blot检测证明rC3B具有抗原性，单核细胞的黏附试验初步确认了纯化后蛋白的活性。结论：确认了人类补体C3的这一活性区域，并获得了该蛋白的功能片段，为深入研究人类补体C3蛋白的功能和应用奠定了基础。【关键词】原核表达Cloning,Expression and Identification of Functional Fragment rC3B of Human Complement C3 in E.Coli Abstract This study was purposed to verify the binding part of human complement C3 to complement receptorⅢ(CRⅢ)in monocytes,the peptide rC3B,including the bindingsite,was expressed,purified and identified.rC3B,the binding part of human complement C3 to CRⅢ,was selected by computeraided modeling and summarizing researches published.Then,rC3B gene fragment was amplified by PCR,and cloned into prokaryotic vector pQE30a.The fusion protein rC3B was expressed in E.coli M15 and purified by Ni2+chelating affinity chromatography.The activity of rC3B was identified by Western blot and adherence assay with monocytes.The results showed that rC3B fragment was obtained,and a prokaryotic expression vector pQE30rC3B was constructed.rC3B was efficiently expressed and purified.In Western blot,the target protein showed the activity of binding with C3 antibody,while the purified protein showed the activity of adherence with monocytes.It is concluded that the recombinant C3B was obtained and identified,and this study lay the basis for the further functional analysis of C3.Key words complement C3;rC3B gene;prokaryote expression;monocyte J Exp Hematol 2007;15(4):827-832补体C3蛋白主要由肝细胞和巨噬细胞产生。人类补体C3基因由41个外显子组成，cDNA编码序列全长约5 052 bp［1］。C3成熟蛋白含1 663个氨基酸，以双链的形式分泌出细胞，其中α链分子量120 kD，β链75 kD。C3分子上存在着众多与其他分子的结合位点，C3通过其上的系列受体位点与补体其它成分、病原体、血细胞等发生广泛的作用，从而在机体的免疫防御和免疫病理中发挥重要作用［2，3］。本研究关注C3上与单核细胞、巨噬细胞表面补体受体的结合位点，也就是补体Ⅲ型受体(CR3，CD11b/CD18)结合位［4，5］。C3裂解片段通过该结合位点与大量存在于单核细胞、中性粒细胞等上的CR3结合，从而促进血液中病原体的吞噬和清除。本研究获取人补体C3补体受体Ⅲ结合区rC3B基因，在原核系统中进行表达，并经过系列纯化得到相应的功能片段，最后用Western blot及单核细胞的黏附试验鉴定功能片段的活性。材料和方法质粒和菌株克隆载体pGEMT为Promega公司产品，表达载体Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶均购自大连宝生物工程有限公司。PCR产物回收试剂盒、胶内DNA纯化试剂盒为美国Promega公司产品。HRP羊抗人C3、HRP羊抗IgG购自北京中山生物技术有限公司；蛋白纯化树脂NiNTA为Amersham Pharmacia公司产品。人类补体C3补体受体Ⅲ结合表位的选择经文献调研，分析人类补体C3补体受体Ⅲ结合位点；计算机模建保证5’、3’不形成二级结构；抗原表位分析后确定了包含最多结合位点的活性区段C3补体受体Ⅲ结合区rC3B（C3 13601430AA）。引物设计与合成根据GenBank公布的人类补体C3全基因序列，设计扩增编码C3补体受体Ⅲ结合区rC3B的引物，并经GOLDKEY软件加以验证。扩增rC3B基因的引物：上游引物Pb1:5’GCGCGGATCCATGTTCGACCTCAAGGTCACC3’；下游引物Pb2:5’AAAACTGCAGTCAGGAGATGTATCTGTC3’。引物Pb1 5’端引入酶切位点BamHⅠ，引物Pb2 3’引入终止密码子TCA及酶切位点PstⅠ，以上引物由上海生工生物公司合成。rC3B基因的克隆以含人类补体C3全基因的质粒pSVC3为模板，在引物对Pb1/Pb2的引导下，PCR扩增C3补体受体Ⅲ结合区基因rC3B，连接到pGEMT载体上后，转化E.coliDH5α感受态细胞，经常规蓝－白斑筛选及PCR鉴定后，对阳性克隆TrC3B1进行测序。重组表达载体的构建和鉴定以BamHI、PstⅠ双酶切TrC3B1、pQE30a质粒，回收酶切片段并进行连接反应，连接产物转化E.coli M15感受态细胞，挑取具氨苄青霉素、卡那霉素双抗性的菌落并经过PCR及酶切鉴定后获得原核表达载体pQE30rC3B，载体构建图谱如图1所示。蛋白在E.coli中的表达以及可溶性检测挑取pQE30rC3B阳性克隆于少量LB培养基(Amp+、Kan+)中过夜活化后，接种至大量LB培养Figure 1.Construction of recombinant expression vector pQE-rC3B.基中，于37℃、250 rpm振摇培养3-4小时，至OD600=0.4-0.6，加入IPTG至终浓度1 mmol/L，37℃诱导5小时，离心收集菌体，反复冻融后重悬于超声缓冲液中，超声破碎细胞，分别收集上清及沉淀，进行SDSPAGE。另外，分别将诱导温度降至20℃，诱导剂IPTG终浓度调整到0.5、0.2、0.1 mmol/L，进行蛋白可溶性表达的检测。rC3B蛋白的纯化平衡NiNTA树脂后装柱，将细菌裂解上清过柱，流速为0.5 ml/min，以10倍柱体积的含20 mmol/L咪唑的缓冲液冲洗，用含300 mmol/L咪唑的缓冲液梯度洗脱，最后将含有高浓度目的蛋白的缓冲液合并，4℃下用缓冲液透析去除咪唑，透析后的蛋白经紫外分光光度计定量后保存于-70℃。表达产物抗原性的Western blot检测表达的蛋白rC3B经过SDSPAGE分离后，转印到硝酸纤维素膜上，Western blot试验测定目的蛋白免疫反应。操作步骤见《精编分子生物学实验指南》。抗体是辣根过氧化物酶标记的羊抗人C3抗体，TMB为显色底物。rC3B蛋白活性的黏附单核细胞（mon）试验单个核细胞（mononuclear cell）的分离新鲜肝素抗凝人全血，4℃1000×g离心20分钟，弃上层血浆和下层血红细胞部分，得到粗分的白细胞部分。然后向50 ml试管中加入20 ml淋巴细胞分离液，缓慢贴壁加入粗分白细胞，2000×g 4℃水平离心30分钟，取最中层即为单个核细胞部分。单核细胞的划分与黏附向分离的单个核细胞中加入FITC标记抗CD14，避光反应5分钟，用PBS清洗后流式细胞术(flow cytomety,FCM)检测阳性标记的单核细胞，并确定单核细胞在流式细胞图上的分区。将纯化的rC3B蛋白与分离的单个核细胞在37℃下孵育1小时，用PBS洗2次后与FITC抗人C3抗体于37℃作用1小时，用PBS清洗后，流式细胞术检测rC3B蛋白与单核细胞的黏附。结果rC3B基因片段的选择与克隆本研究所选择的人C3补体受体Ⅲ结合区rC3B编码70AA，两端分别引入起始密码、终止密码和酶切位点，基因片段长约240 bp。生物信息学分析中，结构预测证明其两端不易形成mRNA二级结构，抗原表位分析使rC3B覆盖尽可能多的结合位点（图2）。在引物对Pb1/Pb2引导下扩增rC3B1，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3所示，rC3B位于约240 bp处，与预期一致。PCR扩增片段与pGEMT载体连接，转化大肠杆菌DH5，经筛选和鉴定后送往测序。结果表明rC3B基因序列与GenBank K02765序列比对一致，序列正确的阳性克隆质粒命名为TrC3B1。pQE30rC3B表达载体的构建和鉴定TrC3B1用BamHI、PstⅠ双酶切得到的基因片段，插入相应酶切的原核表达载体pQE30a，经过抗性筛选和PCR、酶切鉴定获得重组质粒pQE30rC3B。双酶切鉴定结果如图4所示，结果表明获得了约240 bp的rC3B的基因片段，与预期结果相符。Figure 4.Restriction analysis of recombinant plasmid.M:DNA markers(DL2000).Lane 1:pQE-rC3B digested by BamHI+PstⅠ.pQE30a载体介导的融合蛋白表达接种分别携带pQE30a空载体和pQE30rC3B表达载体的E.coli M15菌株于LB培养基中，诱导表达。对全菌裂解液进行SDSPAGE分析结果表明，rC3B蛋白得到大量表达(图5)。改变诱导剂浓度及诱导温度时发现，IPTG终浓度为0.1 mmol/L，诱导6小时时，pQE30rC3B就能得到较大量表达；而诱导温Figure 5.SDS-PAGE of rC3B expressed in E.coli M15.M:protein marker.Lane 1:total cell lysates of M15(pQE30)induced by IPTG.Lane 2:total cell lysates of M15(pQE30-rC3B)induced by IPTG.度37℃、20℃时rC3B均大部分为可溶性表达。凝胶扫描分析结果表明，rC3B表达产物约占细菌总蛋白的40％。rC3B蛋白的纯化pQE30rC3B表达蛋白rC3B携带有6个组氨酸标签，采用Ni2+固相化的螯合Sepharose Fast Flow亲和层析树脂进行纯化，结果如图6所示。洗脱时出现单一蛋白峰，SDSPAGE蛋白电泳显示目的蛋白rC3B得到了高效地纯化。Figure 6.Purification of E.coliexpressed rC3B.1:purified rC3B.2:bacterial lysates of M15(pQE30-rC3B)induced by IPTG.表达产物抗原活性鉴定Western blot结果如图7所示。在丽春红预染出的目的蛋白条带处杂交膜显示明显杂交带，从而在蛋白水平上再次证明rC3B在原核表达系统中的表达，也表明rC3B可与抗人C3多克隆抗体结合，即所表达的人类补体C3受体Ⅰ结合活性区具有补体C3的抗原性。黏附单核细胞（mon）试验分离得到的单个核细胞用CD14标记后，检测到其中被阳性标记的单核细胞占25%-35%（图8），剩余淋巴细胞约60%-70%。另外，也根据细胞大小、内部颗粒多少等不同，在流式细胞术检测时散点图上圈出不同细胞系，所圈细胞系中CD14阳性的单核细胞或阴性的淋巴细胞都超过90%，保证了以Figure 7.Western blot analysis of rC3B expressed in E.coli M15.M:protein marker.Lane 1:total cell lysates of M15(pQE30-rC3B)uninduced by IPTG.Lane 2:total cell lysates of M15(pQE30-rC3B)induced by IPTG.Lane 3:total cell lysates of M15(pQE30)induced by IPTG.下实验结果的可信度。不同浓度纯化的rC3B蛋白及生理盐水（对照组）与单核细胞在37℃下孵育，FITC抗人C3抗体检验rC3B与单核细胞的黏附，流式细胞术检测结果表明，rC3B蛋白能与单核细胞结合，且黏附比例随蛋白浓度升高而加大（图9）。讨论人类补体C3具有介导免疫黏附、调理促吞噬及溶菌、杀菌等多种作用，C3分子的生物学功能都是由其上的系列受体位点所介导，包括其它补体成分结合位点、调节蛋白结合位点、细胞间质结合位点等，其中最主要的是补体受体结合位点。补体受体结合位点分别有CR1、CR2、CR3、CR4、C3a/C4aR、C3eR等多种，它们介导了与红细胞、中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞等多种细胞的结合［6，7］。其中，中性粒细胞和单核巨噬细胞高度表达的补体Ⅲ型受体CR3，与吞噬功能密切相关［8］。CR3具有广谱配体识别能力，很强的信号转导能力，还能协同激活其它重要的黏附和防御受体或直接与其他受体协同作用。CR3众多的功能特性使得它成为白细胞特别是吞噬细胞天然免疫应答的主要调控因素。大量的体内外实验以及对白细胞黏附缺陷(leukocyte adhesion deficiency,LAD）综合征和CR3基因敲除小鼠的研究都有力地证明CR3是一个重要的促吞噬受体［9］。作用机制大致为：CR3通过其凝集素区与微生物表面多糖结合而使之活化，其后直接或与CR1协作后结合沉积在细菌或真菌表面的C3bi，从而有效地启动吞噬过程。国外研究表明，C3补体受体Ⅲ结合区是补体C3的1361AA1430AA［10，11］，但目前尚无从生物制品角度得到并检验其区域活性的报道，我们希望通过基因工程表达包含C3补体受体Ⅲ结合区的片段rC3B，并验证其活性。在rC3B序列的选择中，文献报道的C3补体受体Ⅲ结合区最长结合表位1376AA1430AA共55AA，在蛋白抗原表位预测中我们发现其5’端恰好有1个较明显表位，考虑到其可能也是某一结合位点，且片段太小不易产生抗体用于以后的功能研究，因此我们选择从1361AA起始至1430AA，共70AA。原核表达载体上选用了pQE30a载体［12］，pQE30a携带有T5启动子，Lambda t0转录终止子，在多克隆位点N端有6×HisTag，能使所表达蛋白含有6个组氨酸标签。目的蛋白仅仅增加几个氨基酸，对蛋白质结构影响较小，而且利于表达蛋白的纯化。本实验中rC3B基因克隆入表达系统，获得了阳性重组子pQE30rC3B。在IPTG终浓度为0.1 mmol/L，诱导6小时时，pQE30rC3B能得到大量可溶性表达，表达蛋白可溶性与诱导温度关系不大。在进行SDSPAGE鉴定时，考虑到rC3B分子量较小，我们筛选了分离胶的浓度（12%-20%之间），并最终确定理想的分离胶浓度为18%。但所表达的rC3B表达条带仍然比较靠近凝胶底部，低蛋白分子量标准4.0 kD条带也几乎显示不出。血液中的白细胞不是一个均一的细胞群，根据检测目的不同，分离细胞的需求和技术也各异，现有分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、黏附和吞噬能力进行粗分；另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗原和受体进行选择性分离。本课题首先初步离心分离白细胞，然后利用梯度效应分离单个核细胞，其中含淋巴细胞和单核细胞。单核细胞胞体较大，直径约为15-30μm，胞质内没有颗粒，它们约占血液中白细胞总数的4%-8%。与其他血细胞比较，单核细胞内含有更多的非特异性脂酶，并且具有更强的吞噬作用。单核细胞在血液中停留2-3天后迁移到周围组织中，细胞体积继续增大，直径可达50-80μm，细胞内所含的溶酶体颗粒和线粒体的数目也增多，固定在组织中的单核细胞称为组织巨噬细胞，它们经常大量存在于淋巴结、肺泡壁、肝和脾等器官。通过C3等介导的结合而激活了的单核细胞和巨噬细胞能生成并释放多种细胞毒性细胞、干扰素和白介素，参与机体防卫机制，还产生一些能促进内皮细胞和平滑肌细胞生长的因子［13］，在炎症周围单核细胞还能进行细胞分裂，并包围异物。流式细胞术检测显示，纯化的rC3B蛋白能黏附人单核细胞，这为阐明补体C3与单核吞噬细胞系统的相互作用以及血液中病原体清除的机理提供了依据。本实验通过文献调研和计算机模建确定人类补体C3上补体受体Ⅲ结合区rC3B，钓取rC3B基因，插入原核表达载体pQE30a，并在大肠杆菌中进行表达。Western blot结果证明目的蛋白具有C3抗原性；对表达的rC3B蛋白进行纯化，并通过荧光抗体间接标记法验证，其与单核细胞有黏附功效，这从分子水平确认了C3蛋白的这一活性区域，也为下步研究人类补体C3的功能和应用奠定了基础。【参考文献】1deBruijn MH,Fey GH.Human complement component C3:cDNA coding sequence and derived primary structure.Proc Natl Acad Sci USA,1985;82:708-712 2SReis E,Falcao DA,Isaac L.Clinical aspects and molecular basis of primary deficiencies of complement component C3 and 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