HPLC法测定苦玄参中苦玄参苷IA的含量医学论文.doc

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HPLC法测定苦玄参中苦玄参苷IA的含量_医学论文作者：陈勇，甄汉深，刘婧，李耀华，叶乐【摘要】目的建立苦玄参药材Picria felterrae Lour.的含量测定方法。方法RP-HPLC法，采用C18ODS2柱(5μm，4.6×250mm)，乙腈-0.3%磷酸(34∶66)为流动相，流速为1ml/min，检测波长为264nm。结果苦玄参苷IA进样量在0.42～2.10μg的范围内呈良好的线性关系，r=0.9999，平均回收率为100.4%，RSD=1.64%（n=6）。结论该法操作简便、准确、专属性强，可作为苦玄参药材中苦玄参苷IA的质量控制方法。【关键词】苦玄参；苦玄参苷IA；含量测定；高效液相色谱法【Abstract】Objective To establish a method for the determination in picria fel-terrae Lour.Methods RP-HPLC.The piefeltarraeninIA was separated on a C18ODS2 column(5μm，4.6×250mm)and detected at 264nm and 1ml/min，using acetonitrile-0.3%phosphoric acid(34∶66)as the mobile phase.Results PiefeltarraeninIA in picria felterrae Lour was baseline separated and determined.The linearity rangs was 0.48μg～2.10μg，correlation coefficient was 0.9999.The average recovery was 100.4%（RSD=1.64%，n=6）.Conclusion The method is simple，accurate and with strong specificity and can be used for quantify the main constituient piefeltarraeninIA in picria felterrae Lour.【Key words】picria fel-terrae Lour；piefeltarraeninIA；content determination；high performance liquid chromatography(HPLC)苦玄参Picria fel-terrae Lour.为玄参科苦玄参属唯一的一种植物，主要分布于广西、广东及云南等地。其作为广西民间用药已有二百多年历史，具有清热解毒，凉血消肿之功效，用于治疗感冒风热、咽喉肿痛、痄腮、胃热腹痛、痢疾、跌打损伤、毒蛇咬伤及痈疖等［1］，因其味极苦，别名又称苦草。苦玄参是广西民间常用药，2005年版《中国药典》正文中尚未收载该品种，但有些以其为原料的中成药如妇炎净胶囊等已收载入《中国药典》（2000年版及2005年版）［2］。对苦玄参药材及其中成药中苦玄参苷IA含量的测定已有相关报道［3～6］，但均采用薄层扫描法测定，本文则采用HPLC法对不同产地、不同采收季节苦玄参中苦玄参苷IA进行含量测定，现报道如下。1仪器与试药1.1仪器Agilent 1100高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）：GB15B-DAD二极管阵列检测器，G1314A-VWD可变波长检测器，Agilent化学工作站；Hypersil C18ODS2色谱柱（5μm，4.6×250mm，大连依利特公司）；BP211D电子分析天平（德国赛多利斯公司）；Millipore simplicity-185超纯水器（美国密理博公司）；SB3200T超声波清洗器(上海必能信有限公司)；LG16-W离心机（北京医用离心机厂）。1.2试药苦玄参苷IA对照品由广西桂林植物研究所植化室梁小燕老师提供，经HPLC归一化法检测，含量达到98.0%以上。乙腈为色谱纯(天津四友生物医学技术有限公司)，水为超纯水，其余所用试剂均为分析纯。本实验所用药材经广西中医学院药学院陈勇教授鉴定为玄参科植物苦玄参Picria fel-terrae Lour.的干燥全草。2含量测定方法与结果2.1供试品溶液的制备精密称取约2g苦玄参药材（全草）干燥粗粉，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇25ml，超声处理30min，放冷，补足重量，滤过，滤液备用。取上述样品溶液1ml于微型离心管中，以10000r/min速度离心10min，取上清液备用，即得。2.2对照品溶液的制备精密称取苦玄参苷IA对照品适量（5.25mg），置25ml量瓶中，用适量甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.21mg/ml的对照品溶液。2.3色谱条件色谱柱为C18稳定性ODS2柱(5μm，4.6×250mm，大连依利特公司)，流动相为乙腈－0.3%磷酸(34∶66)，流速为1ml/min，检测波长为264nm，柱温为25℃，理论塔板数按苦玄参苷IA计算应不低于3000。在上述色谱条件下，供试品中苦玄参苷IA色谱峰能与其他成分分离，色谱图见图3.1～3.11。2.4线性关系考察分别精密吸取上述苦玄参苷IA对照品溶液(0.21mg/ml)2μl、4μl、6μl、8μl和10μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积值。以峰面积为纵坐标，对照品进样量(μg)为横坐标，绘制标准曲线，并求出回归方程为y=773.0x+1.85，r=0.9999。结果表明苦玄参苷IA进样量在0.42～2.10μg间呈良好线性关系，结果见表1，色谱图见图1，标准曲线见图2。a为苦玄参苷IA图1苦玄参苷IA对照品HPLC色谱图图2苦玄参苷IA标准曲线图表1苦玄参苷IA线性关系考察结果2.5精密度试验精密吸取苦玄参苷IA对照品溶液(0.21mg/ml)5μl，注入液相色谱仪，重复进样5次，测定苦玄参苷IA峰面积值，计算RSD=0.21%，结果见表2。表2精密度试验结果2.6稳定性试验取供试品溶液（宁明），每隔4h分别进样10μl，测定苦玄参苷IA峰面积值，计算RSD=0.10%，表明供试品溶液在24h内保持稳定，结果见表3。2.7重复性试验精密称取同一产地供试品（平乐）各5份，按样品测定项下方法进行测定，结果见表4。表3稳定性试验结果表4重复性试验结果2.8加样回收率试验精密称取0.2g已测知苦玄参苷IA含量的供试品（龙州）干燥粗粉，分别精密加入一定量的苦玄参苷IA对照品溶液（0.21mg/ml）2ml，按供试品溶液制备方法制备待测溶液，按上述色谱条件测定，按下式计算加样回收率，结果见表5。表5加样回收率试验结果2.9样品测定分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液(0.21mg/ml)各10μl，注入液相色谱仪，测定峰面积值，结果见表6，色谱图见图3.1～3.11。图3.1苦玄参(031013)HPLC色谱图图3.2苦玄参(031217)HPLC色谱图图3.3苦玄参(040218)HPLC色谱图图3.4苦玄参(040830)HPLC色谱图图3.5苦玄参(041012)HPLC色谱图图3.6苦玄参(平乐)HPLC色谱图图3.7苦玄参(宁明)HPLC色谱图图3.8苦玄参(梧州)HPLC色谱图图3.9苦玄参(越南)HPLC色谱图图3.10苦玄参(龙州)HPLC色谱图图3.11苦玄参(龙州叶子)HPLC色谱图表6样品含量测定结果（n=2）3结果讨论(1)分别以甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯为溶剂对苦玄参进行超声提取，提取液进行HPLC测定。结果表明，甲醇、乙醇提取液测得色谱峰的峰面积最大，但乙醇比甲醇的粘度大，不利于滤过净化处理，于是选用甲醇为提取溶剂。比较以不同浓度甲醇为溶剂所测的峰面积，结果75%甲醇测得的峰面积最大，故本实验选用75%甲醇进行提取。(2)分别采用回流提取法和超声提取法进行提取，所得提取液采用HPLC法测定苦玄参苷IA色谱峰的峰面积，结果表明，超声提取法测得苦玄参苷IA含量较高，且时间较短，无其他组分峰干扰，操作步骤简单，故本实验采用超声提取法进行提取。(3)利用DAD检测器可同时获得色谱-光谱三维图谱，从该图谱中可得出苦玄参苷IA的最大吸收波长，进样后测得苦玄参苷IA的最大吸收波长为264nm。(4)本实验采用乙腈-0.3%磷酸为流动相，改变流动相配比进行最佳流动相的选择，结果表明，苦玄参苷IA在流动相为乙腈-0.3%磷酸（34：66）时与相邻组分峰分离度R>1.5，达到分离要求，能完全满足色谱峰定量要求。(5)对同一产地（龙州）苦玄参中不同部位（全草和叶子）的苦玄参苷IA含量进行考察，发现叶子所含苦玄参苷IA较全草高，但相差不大，这说明苦玄参中苦玄参苷IA主要存在于叶子部位，结果见表6。（６）不同产地药材含量测定结果表明，梧州所产苦玄参中的苦玄参苷IA含量最高，而平乐所产含量最低。由于5个不同产地苦玄参的采收季节不同，无法对不同产地的苦玄参含量高低下定论。比较同一产地、不同采收季节的苦玄参中苦玄参苷IA含量，采收季节不同，苦玄参苷IA含量各不相同。所以，苦玄参采收季节不同是影响其含量的一个因素。综上所述，今后对不同产地苦玄参进行含量测定，应将不同采收季节予以考虑，以寻求有效成分含量更高的苦玄参药材。【参考文献】1广西壮族自治区卫生厅.广西中药材标准(1990年版).南宁：广西科学技术出版社，1992，225.2国家药典委员会.中华人民共和国药典2000年版（一部）.北京：化学工业出版社，2000，464.3蒋明廉.苦玄参中苦玄参苷IA的含量测定.桂林医学院学报，1997，10(6)：698.4陈勇.几种苦玄参的中成药定性定量研究.中国现代应用药学，2000，17(2)：106.5陈勇.炎肿化毒片的薄层鉴别及苦玄参苷IA的含量测定．中成药，1997，19(5)：14．６陈勇．炎见宁片的定性鉴别及其苦玄参苷IA的含量测定．中成药，1997，19（12）：12.