沼虾群体分化的差异阐述沼虾群体分化的差异阐述预读:摘要:最新杂志：高中生学习课外语文考试与评价苏州教育信息化中国数学教育中小学音乐教育中学课程资源中学教研中学生数学远程教育武汉教育学院学报芜湖师专学报日本沼虾(Macrobrachium nipponense)隶属于十足目(Decapoda)长臂虾科(Palaemonidae)沼虾属(Macrobrachium),俗称青虾、河虾,广泛分布于全国各地的江、河、湖、沼及水库中,是我国重要的淡水经济养殖虾类［1］.目前已在其遗传多样性方面进行了一定程度的研究,如采用线粒体COI序列［2］、16S rRNA序列［3］、ISSR标记［4］以及RAPD方法［5－7］来分析野生日本沼虾群体的遗传多样性和系统进化.由于多年的近亲繁殖,池塘养殖可能会造成日本沼虾种质资源退化,导致规格越来越小、抗病力越来越差［8］.太湖作为我国第二大淡水湖,具有丰富野生日本沼虾资源,同时也是养殖日本沼虾亲本的主要来源之一,其日本沼虾野生群体目前尚保持了较高的遗传多样性［7］.长江作为我国的重要河流,其上中下游的日本沼虾遗传分化较弱,整个流域的日本沼虾保持着较高的遗传多样性,具有较大的育种潜力［9］.有研究显示长江和太湖野生日本沼虾的生长速率显著高于池塘养殖虾,且生物学及经济性状优良［10］.因此,选择这两地的日本沼虾野生群体进行杂交,可在一定程度上解决目前日本沼虾养殖群体退化的问题.使用一个种的不同群体能够用来进行人工杂交时,必须评估两个群体间是否有足够的差异［11］.AFLP标记具有带型稳定、重复性好、基因组覆盖率高的特点,目前已广泛用于水产经济动物各种研究中［15－16］.因此,本研究筛选日本沼虾AFLP标记,对其太湖群体和长江群体进行差异比较,以期为日本沼虾养殖品种改良等方面提供基础资料.1材料与方法1.1样本与材料处理实验材料于2009年6月分别取自太湖(E120.64°,N31.17°)、长江扬中(E119.82°,N32.25°)河段.拖网采捕若干尾即刻放入冰盒带回实验室,两群体各随机取50尾(雌、雄各25尾),剥去外壳取肌肉用双蒸水清洗干净,并用75%的酒精固定,标记后放入－80℃冰箱保存备用.每次实验从50尾贮存样品中随机选取30尾(雌雄各15尾)为一个样本.1.2 AFLP分析方法用常规酚－氯仿抽提法提取基因组DNA,紫外分光光度计(Amersham Biosciences Ultrospec2100)测定其浓度和纯度,并用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,之后将DNA稀释至50 ng/μL,－20℃保存备用.参照Vos等［14］和Wang等［15］的方法构建AFLP反应体系,引物及接头序列参照Qi等［16］,引物、接头由华大基因合成.预扩增引物为E01(GACT-GCGTACCAATIC－A)和M02(GATGAGTCCTGAG-TAA－C).从64对选择性扩增引物中筛选出扩增带数目适中、背景清晰、多态性高的引物组合(E37－ACG,M55－CGA;E39－AGA,M60－CTC;E42－AGT,M58－CGT)作为选择性扩增的引物.选择性扩增产物经95℃变性5 min后,用4.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳,60 W恒功率电泳约1h后银染,自然晾干.1.3数据统计与分析1.3.1样本基因频率均数差异显著性检验根据相对分子质量标准,对照反应产物在凝胶上的相应位置,估计扩增产物的相对分子质量大小.有清晰条带的记为“1”,无带的记为“0”.统计每个位点出现条带的个体数,得出该位点在每组中出现的频率.本研究严格按照规定在数据满足正态性的基础上进行t检验.数值的正态性检验、F检验、t检验均使用SPSS17.0软件处理,以P＜0.05为差异的显著性水平,P＜0.01为差异的极显著性水平.1.3.2特异性位点差异检验利用χ2检验,分析每个位点在2组日本沼虾中出现的频率是否存在显著差异.χ2检验使用SPSS17.0软件处理.图由Origin 7.0绘制.2结果2.1 AFLP选择性扩增带型结果选用3对选择性引物从太湖、长江两个群体共计60尾日本沼虾的DNA样品中共检出138个不同长度的扩增片段(50～1 000 bp).不同引物组合扩增出的条带在数量和质量上都有不同,本实验选择统计E37M55引物扩增条带数为38(图1);E39M60、E42M58各为50.2.2太湖、长江群体基因频率的统计分析2.2.1样本基因频率均数差异显著性检验3对引物分别测出38～50条清晰的AFLP条带,经计算得出同一对引物组合下的每个位点显性基因频率P,对各频率进行正态性检验结果如表1所示:E37M55、E39M60、E42M58引物扩增得出的基因频率的正态性检验结果P＞0.05,故这3对引物下的基因频率符合正态分布.t检验:方差齐性检验(Levene检验),F=4.372,P=0.037＜0.05,故结论为两组方差不相等.由于两组方差不具齐性,故应选择方差不齐性一行的结果:t=3.373,df=267.908,P=0.001＜0.01(表2),则太湖、长江两群体日本沼虾的基因频率具有极显著差异.2.2.2与地域性遗传分化相关的AFLP标记分析在所有的标记位点中,经χ2检验,52个差异标记位点在太湖、长江两群体日本沼虾间差异显著,差异分布情况见表3,其中有26个位点出现极显著差异(P＜0.01)(表4).在出现极显著差异的26个位点(表4)中,位点BY160、BY320、BY470、BY520在太湖组出现的频率均高于0.75,太湖组与长江组的差值均大于0.5.这26个位点中有23个位点在太湖组中出现的频率极显著高于长江组(图2)(P＜0.01).3讨论3.1群体独立性分析形态学标记的研究结果显示,不同水域日本沼虾群体间形态学特征存在显著差异［17］.对其分子标记的研究显示:距离较远的江苏苏州、江西南昌、云南西双版纳、湖北宜都和新疆博湖的5个地理群体［4］及距离较近的江苏地区十个群体(湖泊、池塘、渔场等)［5］的日本沼虾均显示出一定程度的分化.日本沼虾这种区域性分化的特点与它定居性较强、游泳能力较弱的生态习性有关［1］.本研究与以往单独从条带差异的分析不同,引入了更深入客观的基因频率分析的方法,选取太湖群体和长江群体各30样本,采用AFLP技术并结合严格的生物统计学方法进行了分析,结果显示:本实验两种研究样本基因频率符合正态分布;t检验显示太湖、长江两地的日本沼虾基因频率差异达到极显著的水平(t=3.373,df=267.908,P=0.001＜0.01),说明这两个样本基因频率具有显著差异,这种差异与上述形态和其他分子标记结果相一致.这说明太湖组是独立于长江组的群体,两群体可作为杂交育种的亲本来源.3.2太湖群体特异性地域分化位点分析AFLP技术具有可靠性好、分辨率高、重复性强的特点［18］,适宜于种和种下水平的物种鉴定和分类学研究［14］.Jones等［19］在欧洲8个不同实验室对同种材料进行AFLP分析,其错误率小于0.6%.AFLP标记特异性位点被成功用于不同笛雕仔鱼［20］、苹果品种［21］以及猪品系的鉴定［22］等,AFLP技术对于特异性位点的研究是有效的,位点的差异可作为区分特定类群的重要标志.本实验获得了具有统计学意义的差异位点,这些位点与地域分化紧密相关,有23个位点在太湖组中极显著高于长江组,平均高出0.1,其中位点BY160、BY320、BY470、BY520在太湖组中出现的频率分别为:0.77、0.90、0.87、0.77,在长江组为0.20、0.40、0.33、0.20,两两间的差值均大于0.5,对群体分化的贡献率较大.李思发等［23］运用RAPD－SCAR标记找到了新吉富尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)品系的特异性SCAR标记I,它在“新吉富”群体和基础群体中的出现频率分别为85.7%和16.7%,并且将这个标记作为区别新品系的特异性标记;刘改燕等［24］研究发现HLJWL59作为性别差异位点在62.5%的雌性乌鳢(Channa argus)中被成功扩增出来,该位点被用作雌性乌鳢的特异性标记.综上所述,基因位点频率差异可作为特定群体的区别标记.同样本研究中位点BY160、BY320、BY470、BY520在太湖群体中出现的较高频率,是太湖与长江2个群体在相对封闭的自然环境不定向选择的结果,这些位点可以作为太湖群体区别于长江群体的特异性标记.近十多年来,对日本沼虾野生种质资源保护重视不够,良种选育工作进展缓慢,出现了抗逆性减弱、性早熟、生长减慢、个体小型化等种质退化现象［25］.杂交作为良种选育的重要手段被广泛运用于水产动物育种.筛选到合适的分子标记可以鉴定杂交亲本及其后代.Perez等［26］用ScaI对大西洋鲑(Salmo salar)、褐鳟(Salmo trutta)及其杂交后代的基因组DNA进行酶切分析,找到了它们各自的标记;对栉孔扇贝(Chlamys farreri)(♀)×虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)(♂)进行杂种鉴定,得到了父母本群体的特有条带,确定了杂交子代的杂种身份［27］;运用AFLP标记大黄鱼(Pseudosciaena crocea)(♀)×鮸鱼(Miichthys miiuy)(♂)的杂交子代和亲代得出了杂交一代表现出明显的母本倾向性［28］.本实验选择研究太湖、长江日本沼虾群体差异标记位点可作为种质监管、亲本鉴别、子一代遗传倾向研究的基础资料.
