本地毛形线虫49ku ES蛋白结构基因的分子克隆及原核表达动物医学论文.doc

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本地毛形线虫49ku ES蛋白结构基因的分子克隆及原核表达_动物医学论文【中文摘要】旋毛虫ES(Excretory-Secretory，ES)蛋白，即旋毛虫生长过程中的排泄分泌产物。作为检测抗原，它具有灵敏度高和特异性强等特点；作为免疫原，它可以诱导动物产生较强的免疫保护力，因此具有双重的免疫学功能。同时其编码基因在旋毛虫分类上也具有重要意义。但由于ES蛋白制备困难而限制了它的研究和利用，针对这一问题，本实验用重组DNA技术从本地毛形线虫[Trichinella nativa(T.nativa,T_2)]中分得49ku抗原的编码基因并进一步进行克隆、表达及检测。本实验通过对T.nativa肌幼虫收集后的体外培养及ES蛋白抗原性的分析，确定了旋毛虫ES抗原可以引发较强的特异性免疫反应。根据学者Su XZ发表的编码旋毛形线虫[Trichinella spiralis(T.spiralis,T_1)]49ku蛋白的基因结构，设计并合成了一对PCR引物。直接加Trizol研磨裂解虫体，用RNA提取试剂盒来提取T.nativa的总RNA，再经紫外分光光度计测定样品总RNA含量后，用反转录PCR(Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction,RT-PCR)方法扩增出了T.nativa的目的基因TNPG。将PCR产物与pMD18-T载体连接并经过大肠杆菌增殖后送检测序。序列分析结果表明：扩增出的目的基因TNPG长度为951bp，核苷酸序列同已发表的T.spiralis的序列P49有一定的差异，经同源性分析，二者核苷酸序列同源性为98.63％，推导其所编码氨基酸序列同源性为99.05％。从克隆载体上切下目的基因后，将之插入到原核表达质粒pET-30a的BamHⅠ酶切位点处，将重组原核表达质粒pET-30a-TNPG转化到BL-21感受态表达菌中。经IPTG诱导表达，超声波裂解处理表达菌后，用SDS-PAGE分析表达产物。结果表明：TNPG在原核表达菌BL-21中获得了高效表达，表达产物为40.8ku的融合蛋白，表达量达到菌体总蛋白的22.8％。通过Western blot分析，证明其表达产物可以被小鼠T.nativa阳性血清特异性识别。本实验研究结果揭示：本地毛形线虫(Trichinella nativa)49ku ES蛋白编码基因序列的研究在旋毛虫分类上具有重要意义；在大肠杆菌中表达的T.nativa 49ku重组蛋白，是研制旋毛虫基因重组抗原良好的侯选蛋白，其在旋毛虫病的检测和免疫方面具有潜在的开发和应用价值。