森林脑炎病毒的鉴定以及生物学性状和核苷酸全序列测定的研究动物医学论文.doc

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森林脑炎病毒的鉴定以及生物学性状和核苷酸全序列测定的研究_动物医学论文【中文摘要】本试验对2001年自牡丹江分离的森林脑炎病毒(TBEV)MDJ-01株进行了鉴定以及生物学性状和核苷酸全序列的测定的研究。整个试验以1953年分离的TBEV森张株为对照。TBEVMDJ-01株和森张株经乳鼠脑内接种传代后，乳鼠均发病死亡，但死亡时间不同。两株病毒对BHK-21细胞都敏感，MDJ-01株的病毒滴度较森张株低。理化试验结果表明两株病毒为有包膜、不耐酸的RNA病毒。取接种MDJ-01株的鼠脑制作电镜标本，进行形态学观察，可见有包膜的直径约40nm的球形病毒。应用间接免疫荧光试验进行血清学鉴定，结果表明MDJ-01株为TBEV。通过RT-PCR技术扩增部分E蛋白序列并测序，在Genbank上进行同源性比较，发现MDJ-01株和森张株与TBEV Oshima5-10株的同源性最高，分别为94％、95％，从分子生物学水平上进一步证明MDJ-01株病毒为TBEV。在鉴定的基础上，本实验对两株病毒进行了核苷酸全序列测定。根据Genbank中已公布的TBEV Sofjin-HO株和Oshima5-10株核苷酸序列利用DNAStar软件设计10对引物，利用RT-PCR技术分段扩增病毒cDNA，克隆法测序。病毒基因组5′末端和3′末端序列采用RACE法扩增。测序结果用DNAStar软件拼接，在Genbank中检索6株TBEV编码区核苷酸序列、12株TBEVE蛋白核苷酸序列，并在DNAStar上进行核苷酸序列、由此推导的氨基酸序列比较及构建系统发生树。结果测得MDJ-01株5′端10997nt、森张株5′端10675nt，3′端约200nt均未测出。MDJ-01株和森张株5′-UTR分别长131nt和129nt，同源性为99.7％。MDJ-01株同森张株相比存在4处变异，即G_(19)→A、C_(71)→T、T_(75)→C及50nt后插入两个核苷酸。MDJ-01株和森张株编码区核苷酸序列全长10245nt，共编码3414aa。MDJ-01株与森张株编码区核苷酸、氨基酸同源性分别为98.0％、99.3％，由此认为MDJ-01株由森张株变异而来。MDJ-01株24个氨基酸发生变异，可能引起免疫原性和病毒毒力的改变。通过氨基酸比较还发现12个亚型特异氨基酸，可能是引起TBEV三个基因亚型特性不同的原因。从绘制的系统发生树中发现MDJ-01株和森张株均属于TBEV远东亚型，可能与Oshima5-10株、Sofjin-HO株共同起源于Sofjin株，由此推断TBEV可能经金翅雀、啄木鸟等鸟类在中国东北、前苏联、日本间传播。本试验对MDJ-01株和森张株进行了生物学性状和基因组全序列的比较，这将有助于阐明近年来TBE在我国东北再次发生流行的原因，同时为TBEV全长cDNA克隆、基因组结构与功能、诊断、防治等研究打下基础。486位氨基酸外的11个亚型特异氨基酸未见文献报道过，对于鉴定TBEV新分离株的基因亚型具有重要意义。