小菜蛾代谢解毒酶酶活性探讨论文小菜蛾代谢解毒酶酶活性探讨论文预读:摘要：《应用昆虫学报》2016年第二期摘要【目的】阐明小菜蛾Plutellaxylostella(L.)对乙基多杀菌素的代谢抗性机理,为延缓小菜蛾对乙基多杀菌素抗药性发展及抗性治理技术提供支持.【方法】通过酶动力学方法测定了小菜蛾对乙基多杀菌素高抗、中抗和敏感种群的谷胱甘肽-S-转移酶、羧酸酯酶、乙酰胆碱酯酶和多功能氧化酶4种代谢解毒酶的比活力.【结果】乙基多杀菌素高抗小菜蛾种群的谷胱甘肽-S-转移酶、羧酸酯酶、乙酰胆碱酯酶的比活力分别为15.38、3.15和7.30OD•min-1•mg-1pro,显著高于敏感种群；但乙酰胆碱酯酶在中抗种群和敏感种群中比活力差异不显著；多功能氧化酶在高抗、中抗和敏感种群中的比活力分别为4.97、4.08和4.23OD•min-1•mg-1pro,差异不显著.【结论】谷胱甘肽-S-转移酶、羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶的酶活随着小菜蛾对乙基多杀菌素抗性的增强而增强,而多功能氧化酶的酶活在抗性种群与敏感种群间差异不显著,因此小菜蛾对乙基多杀菌素的代谢抗性机理研究应重点关注这3种酶.关键词小菜蛾,酶活性,乙基多杀菌素,抗药性小菜蛾Plutellaxylostella(L.)属鳞翅目菜蛾科,是十字花科作物重要害虫,严重威胁十字花科蔬菜生产.据统计,一般年份小菜蛾危害可使蔬菜损失达30%～50%,严重时可减产90%以上,甚至绝收,每年给世界造成经济损失4～5亿美元（Furlongetal.,2013）.由于其自身的生理生化特性,小菜蛾几乎对现有杀虫剂均产生了抗性（Zhaoetal.,2006）.乙基多杀菌素Spinetoram是一个新型高效的广谱性农用抗生素,作用于昆虫的烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）和γ-氨基丁酸（GAGB）,受体具有杀虫速度快、持效期长、对有益生物如蜜蜂等影响极小等优点,属新型环境友好型生物农药,成为目前防控小菜蛾的首选药剂（华乃震,2015）.随着乙基多杀菌素的大面积推广应用,小菜蛾对该药剂抗药性的发展成为关注焦点.昆虫的生理/生化抗性在昆虫对杀虫剂抗药性的产生与发展过程中起着主要作用.生理/生化抗性主要包括靶标抗性和代谢抗性两种机制.在靶标抗性和代谢抗性等多种昆虫的抗药性机制中,昆虫体内酶代谢能力增强所导致的是昆虫对杀虫药剂产生抗性的重要机制之一（邢剑飞等,2010）.昆虫体内的羧酸酯酶（CarE）、乙酰胆碱酯酶（AchE）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）以及多功能氧化酶（MFO）等代谢解毒酶酶活的提高及变化是导致昆虫抗药性产生的主要原因之一.本文通过对乙基多杀菌素高抗、中抗和敏感小菜蛾种群3龄幼虫体内乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶和多功能氧化酶4种酶进行活性测定,比较小菜蛾乙基多杀菌素不同抗性种群代谢解毒酶酶活的变化,为研究小菜蛾对乙基多杀菌素抗药性机理提供依据,对小菜蛾抗性治理技术的研究和应用具有积极作用.1材料与方法1.1供试昆虫小菜蛾敏感品系:2002年7月采集于广东广州,在室内不接触任何药剂的条件下连续饲养至今.小菜蛾抗性品系:中抗种群2014年3月采集于广东广州石井菜田；高抗种群由中抗种群通过乙基多杀菌素汰选获得.1.2供试药剂乙基多杀菌素（60克/升悬浮剂）:陶氏益农,α-乙酸萘酯（广州齐云生物技术有限公司,化学纯）,固蓝RR（上海华蓝科技有限分司）,碘化硫代乙酰胆碱（SigmaAldrich）,对硝基苯甲醚（p-NA）（瑞士Adamas-beta公司,分析纯）,2,3-二氯硝基苯（DCNB）（扬中市天力化工有限公司）还原型辅酶Ⅱ（NADPH）（Roche,进口分装）,牛血清白蛋白和考马斯亮蓝G250（上海蓝季科技发展公司）,其它试剂均为国产分析纯.1.3生物测定方法采用叶片药膜法（Zhaoetal.,2002）.用洁净甘蓝Brassicaoleracea,剪成直径6.5cm圆片（避免主叶脉）.将叶片在药液中浸泡10s后取出晾干（25℃,2h）,置于直径6.5cm培养皿中,接入10头3龄初幼虫,覆盖双层吸水卷纸,盖上培养皿上盖.将其正面向上置于温度（25±1）℃,相对湿度65%~70%,光照比（16L∶8D）的培养箱中.每处理4次重复.48h后检查死亡率,计算毒力回归方程、LC50值及其置信区间.小毛笔或尖锐镊子轻触虫体,虫体没有反应或不能协调运动视为死亡.1.4酶源制备将5头3龄幼虫末小菜蛾幼虫置于玻璃匀浆器底部,加入1mL0.2mol/LpH6.0磷酸缓冲液（羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶）、0.1molpH7.5磷酸缓冲液（含0.1%Triton-100）（乙酰胆碱酯酶）、0.1mol/LpH7.5磷酸缓冲液（含1mmol/LEDTA、0.1mmol/LDTT、1mmol/LPTU,1mmol/LPMSF）(多功能氧化酶),置于冰上研磨匀浆,完成后,吸取200L匀浆液转入至1.5mL离心管内,加入200LPBS缓冲液,在4℃下,12000r/min离心5min,收集上清液即为酶源.1.5解毒酶活性测定多功能氧化酶活性参照Qian等（2008）方法.取2mol/LPNA125L,9.6mmol/LNADPH12.5L,酶源112.5L,共250L为反应体系,34℃,水浴30min,取200L加入酶标孔,405nm读数,结果为生成的对硝基苯酚量计算.谷胱甘肽-S-转移酶活性测定参照Zhu等（2000）.取100L酶源,100L1.2mmol/LCDNB,100L12mmol/LGSH分别加入酶标板孔中轻轻混匀,避免气泡产生.保证终浓度为0.4mmol/L,GSH终浓度为4mmol/L,对照则以100L0.2mol/LpH6.0磷酸缓冲液代替酶源参加反应.在340nm下反应5min,每隔10s记录一次光密度值.羧酸酯酶活性测定参照Han等（1998）.取酶源50L,置于96孔酶标板,迅速加入200L0.5g/L的固蓝RR盐和1mmol/Lα-乙酸萘酯,450nm下反应10min,每隔12s记录一次光密度值.乙酰胆碱酯酶活性测定参照Byrne和Devonshire（1993）的研究方法.取50L酶源、50L0.1mol/LPBS(pH7.5)、100L0.75mmol/L碘化硫代乙酰胆碱和100L0.05mmol/L的硫代双硝基苯甲酸（DTNB）加入96孔酶标板,反应总体积为300L.在405nm下每隔30s记录一次光密度值,共记录30次.1.6蛋白含量测定参照Bradford（1976）考马斯亮蓝G-250方法.1.7数据统计分析数据统计分析采用DPSv8.01数据处理软件的Duncan氏新复极差测验法进行差异显著性分析（唐启义和冯明光,2007）.2结果与分析2.1不同品系小菜蛾室内毒力测定结果以10g/mL筛选获得小菜蛾对乙基多杀菌素高抗种群,并对该种群进行了室内毒测定,测定结果表明,该种群对乙基多杀菌素的致死中浓度达11.12mg/L,是敏感种群的556倍,根据中华人民共和国农业行业标准NY/T2360-2013,其抗性达高水平抗性,如表1所示.2.2谷胱甘肽-S-转移酶活性谷胱甘肽-S-转移酶的活性随着小菜蛾对乙基多杀菌素抗性水平的提高而增强.其中,中抗种群的酶活为13.67OD•min-1•mg-1pro,与敏感种群的比值为1.8；高抗种群的酶活为15.38,是敏感种群的2.02倍,如表2所示.2.3羧酸酯酶活性如表3所示,对乙基多杀菌高抗的小菜蛾体内羧酸酯酶活性略高于对乙基多杀菌素中抗的小菜蛾体内羧酸酯酶活性.两者差异不显著.但与敏感种群相比,中抗和高抗品系小菜蛾体内羧酸酯酶活性显著高于敏感品系小菜蛾体内羧酸酯酶活性.2.4乙酰胆碱酯酶活性当小菜蛾对乙基多杀菌素的抗性达到556倍的高抗水平时,其乙酰胆碱酯酶的活性提高,达到敏感种群的1.65倍,如表4所示.但在中等抗性小菜蛾种群中,乙酰胆碱酯酶活性与敏感种群的并没有显著差异.2.5多功能氧化酶活性小菜蛾多功能氧化酶的活性并不随着对乙基多杀菌素抗性水平的变化而变化.如表5所示,高抗种群小菜蛾的多功能氧化酶活性虽然略高于敏感种群和中抗种群的,但三者之间并没有显著差异.3讨论当昆虫受到外界刺激时,其体内活性酶会迅速做出反应,从而存活下来（唐振华和毕强,2003）.昆虫抗药性与其体内靶标酶（如乙酰胆碱酯酶）的敏感性下降以及多功能氧化酶(MFO)、谷胱甘-S-转移酶和特异性酯酶的活性增强有关（陈之浩等,1992；吴刚等,2002；罗雁婕等,2008）.羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶是昆虫体内的一种水解酶系,二者含量的升高均会导致昆虫抗性的升高（邢剑飞等,2010）.羧酸酯酶主要通过代谢、分解体内某些内源或外源的有毒物质,将其排出体外来保护机体的正常机能.其在昆虫降解杀虫剂方面扮演着重要的角色（郭丽和沈孝兵,2004；Holmesetal.,2008）.羧酸酯酶活力增加是棉蚜AphisgossypiiGlover,桃蚜Myzuspersicae,东亚飞蝗Locustamigratoriamanilensis（Meyen）对有机磷杀虫剂产生抗性的原因（Caoetal.,2008；Panetal.,2009；Zhangetal.,2011）；棉蚜对溴氰菊酯的抗性是由于羧酸酯酶的不敏感性降低而引起的（赵善欢,2001）；阿维菌素类杀虫剂的抗性产生与羧酸酯酶的活性增强有关（吴青君等,2001）.王光峰等（2003）研究表明多杀菌素在活体条件下能够诱导甜菜夜蛾体内羧酸酯酶活性的增强.本研究结果表明抗乙基多杀菌素小菜蛾的羧酸酯酶活性明显高于敏感种群小菜蛾,这说明小菜蛾对乙基多杀菌素的抗药性与羧酸酯酶活性的增加有关.乙酰胆碱酯酶通过快速水解神经递质乙酰胆碱而中止神经冲动的传递,其对杀虫剂敏感性降低是昆虫产生抗性的一个重要原因（孟琳琳等,2010）.本研究表明,在高抗小菜蛾体内乙酰胆碱酯酶比活力显著高于敏感品系,而中抗小菜蛾体内乙酰胆碱酯酶较高抗品系略低,说明乙基多杀菌素对小菜蛾体内乙酰胆碱酯酶活性的影响随着抗性的变化而变化,其具体变化机制有待进一步研究.谷胱甘肽-S-转移酶是一种昆虫体内与抗性有关的初级代谢及次级代谢酶系,其解毒作用是催化谷胱甘肽的轭合,形成一个能够被排泄出的产物；与底物形成一个非共价键,由此作为一个携带蛋白质,把底物带到一个可以代谢或排泄的部位；即形成一个共价键,使底物与酶都失去活性（陈秀华等,2013）.尹显慧等（2008）年研究表明,多杀菌素对小菜蛾谷胱甘肽-S-转移酶具有诱导作用.小菜蛾体内谷胱甘肽-S-转移酶的高活力是小菜蛾对有机磷类杀虫剂产生抗药性的重要机制之一（吴刚等,2000；吕敏等,2003）.以上研究与本研究结果一致,乙基多杀菌素诱导小菜蛾体内谷胱甘肽-S-转移酶的活性,抗性小菜蛾种群中谷胱甘肽-S-转移酶活性显著高于敏感种群.多功能氧化酶在小菜蛾对阿维菌素的抗性中起着重要的作用（梁沛等,2001；黄剑,2005）.但本研究表明,抗性品系小菜蛾与敏感品系小菜蛾相比,其体内多功能氧化酶活性差异不显著,说明小菜蛾对乙基多杀菌素的抗药性与些酶无关.小菜蛾对乙基多杀菌素的抗药性是一个复杂的过程,本研究结果为乙基多杀菌素对小菜蛾的作用机理研究提供一定的理论基础,但其具体的作用方式需要进一步从基因水平加以验证.
