素类兽药抗生素对白菜种子发芽抑制的毒性效应素类兽药抗生素对白菜种子发芽抑制的毒性效应预读:摘要:最新杂志：新作文·中学教学版新语文学习·高中新闻与成才新闻通讯新闻采编新闻爱好者·上半月新上海档案新教育新疆师范大学学报·新高考·文科版新德育·思想理论教孝感职业技术学院学随着我国集约化养殖业的发展和畜禽粪便作为肥料的大量使用,土壤中抗生素污染问题就已受到人们的普遍关注.金霉素(Chlortetracycline,CTC)和土霉素(Oxytetracycline,OTC)是两种畜禽饲养过程中常用的四环素类抗生素,常被添加到动物饲料中,以预防、治疗动物疾病和促进动物生长,且常以原药形态排出体内.四环素类兽药抗生素不断地进入土壤环境,从而导致其在土壤中积累并对土壤生态环境产生影响[1-2].目前,国内外已有关于抗生素在植物、农作物生态毒性方面的报道[3-8].土壤中四环素类药物的植物毒性研究亦引起学者的广泛关注[7-10],但大多集中于水生生物的研究和非热带土壤的作物毒性研究.兽药胁迫下对热带土壤中的蔬菜种子的毒性影响尚少见报道.植物种子在抗生素的污染条件下能否正常发芽是植物能否在受污染的土壤中生长的先决条件.在生态毒理学研究中,植物种子发芽和生长以及芽长等指标在外源化合物胁迫下的效应已被国内外诸多学者采用[11-14].故本文以金霉素(CTC)和土霉素(OTC)2种不同的四环素类抗生素为供试污染物,以白菜为测试生物,通过白菜种子在2种不同的介质中(包括水溶液和砖红壤)的萌发试验研究此类抗生素的生态毒性,为四环素类抗生素污染土壤的生态风险评价提供依据.1材料与方法1.1供试材料供试土壤采自海南大学儋州校区橡胶园地,为发育自花岗岩的旱地砖红壤.供试土壤均为表土(0~20cm),土壤采集后风干、磨碎、过2mm尼龙筛备用.土壤理化性质和抗生素含量见表1.土壤理化性质的测定均采用国家标准方法进行.土霉素和金霉素的测定参考文献[15].供试作物为白菜(Brassicapekimensis)购自广西玉林市红生种子经营部,采购后手选去除杂物和发育不良的种子.试验所用的主要仪器有受控智能人工气候培养箱(杭州钱江ZRX-300D),9cm硬质玻璃培养皿,无灰定性滤纸.盐酸土霉素(纯度96%)购自华曙制药集团,盐酸金霉素(纯度98%)购自浦城正大生化有限公司；试验用水为Spring-S60i+PALL超纯水系统制备.1.2试验方法1.2.1预备试验（1）土培试验准确称取50.00g土壤于玻璃培养皿(9cm)中,添加质量分数为几何级数设置的抗生素溶液,用玻璃棒搅拌均匀,此时其土壤水分质量分数约为最大持水量的60%.当抗生素质量分数过大时,采用以下方法进行：将抗生素与少量土壤混合,再逐次递增土壤,多次混合使其均匀染毒,调节土壤水分质量分数.土壤染毒后,置于人工气候培养箱中,(25±0.5)℃下平衡2d后,用医用摄子将种子均匀播种于土壤中(应尽量保持种子胚根末端与其生长方向呈直线),加盖后置于人工气候培养箱中,(25±0.5)℃暗处培养,培养时间为72h.（2）水培试验移取3mL不同质量浓度的抗生素溶液于铺有一层定性滤纸的9cm规格的玻璃培养皿中.用医用镊子将种子均匀排列其中,注意保持种子胚根末端与生长方向呈直线.每个培养皿放置15粒,盖好培养皿并于电子天平上称质量,记录原始质量后,置于受控智能人工气候培养箱中,(25±0.5）℃暗处培养.每日用称重法加水保持恒重以补充所蒸发的水分,在保持溶液中抗生素质量浓度恒定条件下进行发芽培养[16].当对照种子发芽率趋于稳定(发芽率>80%),根长度约20mm时,预备试验结束.种子发芽和根伸长抑制率(IC)达到10%~60%范围,方可开始正式试验,并以此作为确定抗生素质量浓度梯度的依据.1.2.2正式试验基于预备试验的结论,在IC10~IC60的区间内,设置6种抗生素质量分数(质量浓度).抗生素污染胁迫下对白菜的毒性效应实验设计如表2所示.每个处理为15粒种子,每个处理共设3个重复,同时设置空白对照,具体方法同1.2.1.试验中定期观察种子发芽数、根长和芽长等毒理指标,并对质量分数(质量浓度)和抑制率关系进行回归分析.1.3指标测定与方法本文选择发芽率、芽伸长、根伸长及相应的抑制率等指标进行毒理学研究.具体计算同文献[17].1.4统计分析方法本研究采用国际通用SAS统计软件和MicrosoftExcel软件进行实验数据的处理及相关统计分析,采用Duncan法进行多重比较检验处理间差异程度.统计软件进行模型拟合,计算IC50值.2结果与分析2.1抗生素对白菜发芽率的影响本研究选择水培和土培两种方法比较典型四环素类抗生素(金霉素和土霉素)污染对白菜发芽的影响.图1可知,当土壤中添加外源土霉素时,白菜种子发芽率总体呈下降趋势.而当添加金霉素时,白菜种子发芽率在85%附近波动,与对照相比,并无显著差异(P>0.05).在水培条件下(图2),金霉素对白菜的抑制作用大于土霉素,但并未达显著差异水平(P>0.05).土霉素和金霉素对发芽率的影响均不甚明显,这可能与种子萌发的淀粉酶等有关,也可能是种皮对这两种化合物有一定的屏障作用.2.2抗生素污染对白菜根伸长的影响由图3可见,白菜根伸长量随着土壤、水溶液中土霉素和金霉素质量分数(质量浓度)的增加而缩短,生长均受到抑制.分别以白菜根伸长指标与两种抗生素的质量分数(质量浓度)为自变量和因变量,利用SAS软件进行统计回归分析,结果如表3所示.无论是水培还是土培条件下,二者均为极显著的对数相关(P<0.01).从上述分析可知,不同介质中2种抗生素的抑制作用趋势相似,白菜根伸长在不同质量分数(质量浓度)处理土壤中受到抑制作用不同,不同介质抑制程度不同,污染物质量分数(质量浓度)越大,抑制作用越大.前人研究发现,出生的根生长点细胞是植物中最重要的络合毒物分子的部位,也是最容易受毒物分子影响的部位,因而在污染土壤中其细胞的分裂受到抑制,表现为根的长度被抑制[14].本实验中同样得出土霉素和金霉素抑制白菜的根生长,与土壤污染程度呈正相关关系,因此,白菜根伸长长度可作为诊断土霉素、金霉素对土壤毒性的敏感指标,反映土壤被四环素类抗生素污染的状况.2.3抗生素对白菜根伸长抑制率的影响以根伸长抑制率对抗生素质量分数(质量浓度)作回归分析结果如图4所示.由图可见,白菜根伸长抑制率与土壤及水溶液中抗生素质量分数(质量浓度)均呈明显线性关系,根据拟合相关系数（r值）,可知对根伸长抑制率的呈现出极显著相关性(P<0.01).抗生素在土培条件下对作物的生态毒性小于水培条件,这可能与土壤对外源化合物具有较强的缓冲能力有关.土壤对此类抗生素有强烈的吸附作用,从而使之不易向土壤水溶液中释放迁移,从而降低其生物有效性[18].在水培中,同一质量浓度条件下,两种外源抗生素对白菜根伸长抑制率表现为：金霉素>土霉素.目前,经常采用植物的IC50值来评价污染物的生态毒性强弱[19-20].本研究中(表4),水培条件下白菜对金霉素的IC50值为20.32mg•L-1,而对土霉素的质量浓度为287.52mg•L-1,这进一步说明在水溶液中金霉素对白菜根伸长的毒害作用强于土霉素.在土壤中,白菜对金霉素的IC50值分别为851.08mg•kg-1,而对土霉素的质量分数为14045.75mg•kg-1,说明在土壤中土霉素对白菜的毒性作用小于金霉素.同时,介质类型明显影响污染物的IC50,土壤中的IC50显著大于水溶液中IC50,说明热带土壤对土霉素具有很强的缓冲作用从而降低了作物对污染物的敏感性.2.4抗生素对白菜种子发芽和根伸长抑制率的影响比较由图5可知,白菜的根伸长抑制率与外源抗生素质量分数成正比；而发芽抑制率呈现无规律变化.对于土霉素来说,芽长抑制率大于根长抑制率,但随着外源OTC质量分数的增加,两者间的差异不断减少.另外,外源OTC对于白菜芽伸长的影响并不显著；而对于金霉素来说,芽长抑制率总体小于根长抑制率.由图5的相关性分析可见,白菜根伸长抑制率与土霉素或金霉素的质量分数有极好的相关性(R2=0.9690,0.8109),而出芽抑制率与土霉素或金霉素的质量分数间的相关性较差(R2=0.6523,0.3057).种子在发芽过程中除受外源化合物或环境件胁迫外,还可从胚内获得养分.仅在外源污染物质量分数较高时或环境条件极其恶劣时才对种子萌发完全或严重抑制.土壤污染对种子的毒害作用被部分掩盖,可能是影响种子发芽对污染物敏感的原因之一.种子在发芽阶段,种子体内各类与萌发有关的重要的酶如蛋白酶和肽酶等纷纷活化,将贮藏于种子内的淀粉、蛋白质和脂肪分解用于合成幼根、幼苗的细胞组成成分.这一过程中种子发芽受到土壤环境中污染物抗生素的影响较小,但是作物根系从发芽开始一直生长于土壤中,土壤条件对作物生长发育的影响较大,因此,根对土壤污染的反应更敏感和直接.这一结果与前人的研究结果相似[21-22].在外源污染物存在时,导致根伸长受阻,可能是污染物抑制了土壤中的微生物活性,使土壤中营养物质转化受阻,影响作物根对营养物质的吸收,导致作物根尖细胞有丝分裂数明显减少,分裂速度减慢,从而导致根伸长受限制[23].另外,两种抗生素本身在土壤环境中的环境行为(如吸附、降解等)存在差异,导致其生物有效性不同,进而可表现出对作物毒性的差异.3结论(1)在实验设置的质量分数(质量浓度)范围内,金霉素和土霉素对白菜幼芽各部分的毒害作用不同.金霉素和土霉素对白菜种子萌发的毒作用差别不明显,对芽长和根长的毒作用差别比较大.金霉素对白菜芽伸长和根伸长的抑制作用稍强于土霉素.(2)抗生素在土壤中的生态毒性效应明显低于水溶液,这可能与土壤对抗生素有很强的缓冲作用有关.(3)金霉素和土霉素对供试作物的生态毒性敏感性表现为：根伸长>芽伸长>发芽率.白菜根伸长抑制率与金霉素、土霉素的质量分数(质量浓度)有极好的相关性,芽伸长抑制率次之,发芽率抑制率最差.根伸长抑制率可作为诊断土霉素、金霉素对土壤毒性的敏感指标,反映土壤被四环素类抗生素污染的状况.(4)土培条件下,不同抗生素对供试作物的芽长和根伸长抑制效应存在差异.白菜根伸长抑制率与两种抗生素的质量分数有极好的相关性,但出芽抑制率则相反.这可能与不同化合物的结构组成对其生物有效性的降低程度不同有关.
