HBV持续感染患者调节性T细胞检测及其意义医学论文.doc

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HBV持续感染患者调节性T细胞检测及其意义_医学论文作者：赵爽孙均周培培徐娟颜学兵【摘要】目的研究调节性T细胞(Treg)在慢性乙型肝炎(CHB)发病机制中的作用，为寻找治疗CHB的新方法奠定基础。方法用流式细胞仪检测了75例CHB患者和30例慢性乙型肝炎病毒(HBV)携带者外周血中Treg含量，CHB患者中HBeAg阳性患者39例，HBeAg阴性患者36例，慢性HBV携带者中HBeAg阴性和HBeAg阳性患者各15例。并对其中23例CHB患者服用核苷(酸)类似物前后外周血Treg含量进行检测。结果CHB患者外周血Treg含量明显高于慢性HBV携带者(P<0.05)，而CHB和慢性HBV携带者中HBeAg阴性和HBeAg阳性患者外周血Treg含量均无明显差异(P>0.05)。经核苷(酸)类似物治疗12周后，CHB患者外周血Treg含量较治疗前有所降低(P<0.05)。结论Treg在HBV致病机制中起一定的作用，体外调控Treg含量和功能可能为治疗HBV感染提供一个新的途径。【关键词】慢性乙型肝炎;慢性HBV携带者;调节性T细胞Abstract:ObjectiveTo investigate the role of T regulatory cell(Treg)in the pathogenesis of chronic hepatitis B(CHB)and lay the basis for new therapy of CHB.Methods In 75 patients with CHB and 30 HBV carriers underwent determination of Treg levels in the peripheral blood by flow cytometry,of whom there were 39 HBeAg-positive patients,36 HBeAg-negative patients,15 HBeAg-positive carriers and 15 HBeAg-negative carriers.The Treg levels in the peripheral blood were determined before and after administration of nucleos(t)ide analogues in 23 CHB patients.ResultsThe Treg levels in the peripheral blood in CHB patients were significantly higher than those in the chronic HBV carriers(P<0.05),while there was no significant difference in Treg levels in the peripheral blood betweenHBeAg-positive and HBeAg-negative CHB patients and chronic HBeAg carriers(P>0.05).12 weeks after nucleos(t)ide analogue therapy,Treg levels in the peripheral blood in CHB patients had a statistical decrease compared with the baseline(P<0.05).ConclusionTreg plays an important role in the pathogenesis of CHB.External regulation of the level and function of Treg might provide a new means for the therapy of HBV infections.Key words:chronic hepatitis B;chronic HBV carrier;T regulatory cell CD4+CD25+调节性T细胞(T regulatory cell，Treg)是重要的免疫抑制细胞[1]，几乎抑制所有的免疫反应，在机体免疫系统中发挥负向调节作用。其最明确的功能标志是对CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖及细胞因子分泌的抑制功能。目前认为CD4+CD25+Treg可以抑制细胞毒性T细胞(cytotoxic cell，CTL)反应及其功能和干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)的分泌，对于乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染慢性化可能起到关键性的作用。但关于Treg的研究还处于起步阶段，国内外研究对于慢性HBV感染患者外周血中CD4+CD25+Treg的比例是否升高仍有争议。我们分析目前研究中Treg的比例检测的差异可能主要是由于当前对Treg界定及检测方法不同所致。研究小组多采用流式荧光技术，通过检测细胞表面的抗原分子，同时结合Foxp3mRNA的表达水平来判定CD4+CD25+Treg的含量。Foxp3虽被认为是Treg的特异性标志，但其属于胞内蛋白，检测时需细胞破膜处理，可能会影响检测的结果和下游的实验，故检测结果并不稳定。我们的实验用流式细胞仪检测Treg表面双标志物CD4+/CD25+的方法，研究慢性乙型肝炎(chroinc hepatitis B，CHB)患者和慢性HBV携带者外周血Treg含量的差异以及核苷(酸)类似物治疗前后Treg含量的差异，以研究Treg在HBV致病机制中的作用，为临床治疗CHB提供理论依据。1资料和方法1.1研究对象和分组75例CHB患者和30例慢性HBV携带者来自2006年12月—2008年6月徐州医学院附属医院感染性疾病科住院和门诊患者，其中男性65例，女性40例，年龄18～60岁，平均年龄(41.8±4.6)岁。正常对照组(NC)20例来自徐州医学院附属医院健康体检中心，既往身体健康，无其他基础病，其中男性11例，女性9例，平均年龄(40±4.2)岁。CHB组中HBeAg阳性患者39例，HBeAg阴性患者36例，慢性HBV携带者中HBeAg阴性和HBeAg阳性患者各15例。CHB患者中有27例服用核苷(酸)类似物治疗(其中4例患者在治疗12周前失访，10例服用恩替卡韦，13例服用阿德福韦酯)。CHB诊断依据2000年西安全国病毒性肝炎会议制定的诊断标准，排除甲型肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎、药物性和酒精性肝病、自身免疫性肝病等。1.2标本的收集与处理所有患者采外周血1 ml用EDTA抗凝，直接用流式细胞仪检测CD4、CD25。1.3流式细胞仪检测CD4、CD25抗体购于杭州联科公司。将相应抗体分别加入2只空白离心管中，分别为阳性管和阴性管，每管分别加入抗凝外周血100μl，充分混匀，4℃避光20 min。在全血样本中加入溶血剂1 ml，混匀放置10 min,全血样本PBS洗涤3次，培养管洗1次，沉淀用200μl PBS悬浮，上流式细胞仪检测。1.4统计学处理SPSS 11.0统计软件对数据进行分析，计量资料两组间比较采用t检验。P<0.05认为差异有统计学意义。2结果2.1CHB患者和慢性HBV携带者外周血Treg含量比较CHB组外周血Treg含量明显高于慢性HBV携带者(P<0.05)，见表1。表1CHB患者和慢性HBV携带者Treg含量比较2.2CHB患者中HBeAg阳性与阴性患者外周血Treg含量比较CHB患者中HBeAg阳性与阴性患者外周血Treg含量比较无明显差异(P>0.05)，见表2。表2Treg含量比较2.3HBV携带者HBeAg阳性与阴性患者外周血Treg含量比较HBV携带者HBeAg阳性与阴性患者外周血Treg含量无明显差异(P>0.05)，见表3。表3Treg含量比较2.4核苷(酸)类似物治疗前后Treg含量比较经核苷(酸)类似物治疗12周后外周血CD4+、CD25+、Treg含量均有所下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表4。表4核苷(酸)类似物治疗前和治疗12周后比较3讨论目前全世界CHB发病率高，CHB相关的肝硬化和肝癌的病死率也逐年增加，严重威胁着人类的健康。但是HBV感染后慢性化的确切机制尚不明确，所以目前尚无有效的治疗方法和方案。因此，明确HBV感染慢性化的发病机制，可为CHB的临床治疗提供新的线索和可靠的理论依据。近年来认为乙肝免疫学治疗的关键在于如何打破免疫耐受状态，诱导有效的机体免疫，抑制并清除HBV。但因CHB的免疫发病机制不明确，尚无可行的方法。目前发现Treg对CD4+、CD8+T细胞、B细胞和NK细胞等多种天然和适应性免疫应答有广泛的抑制作用[2]。研究表明，机体可能更主要的是通过Treg以“主动”的方式来获得和维持自身耐受。Treg尤其在病原体的慢性持续性感染过程中起到维持免疫耐受的作用[3]。在对丙型肝炎病毒、艾滋病病毒的研究中提示Treg可抑制T细胞的增殖和功能因子的分泌。而其在慢性肝炎中的抑制作用，则很可能促进了病毒的持续感染[4]。我们的研究提示CHB患者外周血Treg含量明显高于慢性HBV携带者，提示Treg在慢性乙型肝炎的免疫耐受中起一定的作用。Treg的存在可能使HBV和机体的效应细胞之间维持一种稳态，既可以使机体维持保护性免疫，避免激发过度的免疫反应而引起肝脏组织病理损害，但也会造成病毒在机体的持续存在。研究报道肝脏能够通过肝窦内皮细胞作为抗原提呈细胞诱导CD4+T细胞转变为免疫抑制状态的细胞表型[5]。是否能通过调节Treg的功能，增强乙型肝炎特异性免疫而寻找到治疗CHB的方法，我们已经加大样本量进行进一步研究。有关CD4+CD25+Treg与HBeAg阳性和阴性的关系，报道不一。Stoop等[6]比较了24例HBeAg阳性和26例HBeAg阴性患者外周血中CD4+CD25+Treg的含量，认为HBeAg阳性患者的Treg明显高于HBeAg阴性的患者，而Franzese和福军亮等[7-8]的研究认为外周血Treg含量在HBeAg阴性与HBeAg阳性CHB患者中无统计学差异。我们的研究显示CHB和慢性HBV携带者中HBeAg阴性和HBeAg阳性患者外周血Treg含量无明显差异。这与Franzese和福军亮等的研究结果相似。抗病毒治疗是目前CHB患者的主要治疗方法。目前的抗病毒药物主要有IFN-α和核苷类药物。核苷类似物治疗的主要作用是通过抑制病毒复制而减少肝细胞炎症，从而减少肝硬化和肝癌的发生率。目前尚没有抗病毒药物影响宿主免疫功能的明确证据。我们的研究提示经核苷(酸)类似物治疗12周后，外周血Treg含量均较治疗前有所降低，而Treg的减少与低表达将使机体被抑制的免疫反应有所恢复。Stoop、Franzese的研究小组均认为CD4+CD25+Treg外周血含量与病毒载量之间无明显的关联，这与我们实验的前期研究结果(外周血Treg含量与HBV DNA无明显相关性)相符[9]。我们推测经核苷(酸)类似物治疗后Treg的下降与低表达可能会导致患者免疫功能的部分恢复，以利于机体内病毒的清除。我们的实验说明经过抗病毒治疗，可以一定程度上改善患者的免疫功能。我们的研究结果有利于进一步揭示Treg与HBV感染慢性化的关系，为发展针对HBV感染的免疫治疗提供新的思路。【参考文献】[1]Sakaguchi S,Sakaguchi N,Asano M,et al.Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains(CD25).Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases[J].J Immunol,1995，155(3):1151-1164.[2]Ralainirina N,Poli A,Michel T,et al.Control of NK cell functions by CD4+CD25+regulatory T cells[J].J Leukoc Biol，2007，81(1):144-153.[3]Aseffa A,Gumy A,Launois P,et al.The early IL-4 response to Leishmania major and the resulting Th2 cell maturation steering progressive disease in BALB/c mice are subject to the control of regulatory CD4+CD25+T cells[J].J Immunol，2002，169(6):3232-3341.[4]Peng G,Li S,Wu W,et al.Circulating CD4+CD25+regulatory T cells correlate with chronic hepatitis B infection[J].Immunology，2008，123(1):57-65.[5]Limmer A,Knolle PA.Liver sinusoidal endothelial cells:a new type of organ-resident antigen-presenting cell[J].Arch Immunol Ther Exp(Warsz)，2001，49(Suppl 1):S7-S11.[6]Stoop JN,van der Molen RG,Baan CC,et al.Regulatory T cells contribute to the impaired immune response in patients with chronic hepatitis B virus infection[J].Hepatology，2005，41(4):771-778.[7]Franzese O,Kennedy PT,Gehring AJ,et al.Modulation of the CD8+-T-cell response by CD4+CD25+regulatory T cells in patients with hepatitis B virus infection[J].J Virol，2005，79(6):3322-3328.[8]福军亮,徐东平,赵平,等.急慢性乙型肝炎患者外周血调节性T细胞鉴定与临床意义分析[J].中华医学杂志,2006,86(22):1522-1525.[9]颜学兵,赵爽,周培培,等.慢性乙型肝炎患者调节性T细胞检测及调控因素研究[J].中国医学检验杂志,2009,10(2):47-49.