PPARα激动剂抑制脂多糖诱导THP-1细胞的细胞组织因子表达医学论文.doc

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PPARα激动剂抑制脂多糖诱导THP-1细胞的细胞组织因子表达_医学论文作者：董春霞，胡豫，王华芳，孙春艳，王雅丹，何文娟，张小平【摘要】本研究探讨过氧化物酶体增殖物激活型受体α（peroxisome proliferator-activated receptor-α，PPARα）的激动剂对单核细胞株THP-1中组织因子（tissue factor,TF）表达的影响。用不同浓度的PPARα激动剂非诺贝特（fenofibrate）预处理单核细胞THP-1一定时间，然后分别用RT-PCR和Western blot法检测由细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的单核细胞TF mRNA和蛋白质表达水平。结果显示：非诺贝特减少了LPS诱导的人单核细胞TF mRNA和蛋白质的表达，并呈剂量依赖性（P<0.05-0.01）。结论：非诺贝特抑制了THP-1中LPS诱导的TF表达，此机制可能参与了PPARα激动剂的抗动脉粥样硬化作用。【关键词】组织因子；PPARα激动剂；非诺贝特；动脉粥样硬化；血栓形成PPARαAgonist—Fenofibrate Inhibits LPS-induced Tissue Factor Expression in THP-1 Cells AbstractThis study was aimed to investigate the influence of PPARαagonist on the expression of TF（tissue factor）in THP-1 cells.THP-1 cells were pretreated with different concentrations of PPARαagonist（fenofibrate）for definite time.Lipopolysaccharide（LPS）-induced TF mRNA and protein levels were detected by RT-PCR and Western blot respectively.The results showed that fenofibrate decreased tissue factor protein and mRNA expression in supernatants of LPS-stimulated human monocytes in a concentration-dependent manner(P<0.05-0.01,n=5).It is concluded that fenofibrate inhibite TF expression induced by LPS in THP-1 cells,which may be involved in the anti-atherosclerotic effects of PPARαagonist.Key wordstissue factor；PPARαagonist；fenofibrate;atherosclerosis;thrombosis组织因子（tissue factor,TF)是一种膜表面蛋白，与凝血因子Ⅶ/Ⅶα结合后启动凝血途径的级联反应［1］。TF在人类动脉粥样硬化损伤处的单核/巨噬细胞和泡沫细胞的富脂质面表达异常，作为血栓形成中主要的促凝因素在急性冠脉综合征中发挥重要作用［2］。循环血中单核细胞TF活性表现为在局部受其内源性抑制物——组织因子途经抑制物（tissue factor pathway inhibitor,TFPI）的调控。有研究者证实，单核细胞TF表达降低，可以减少急性冠脉综合征临床事件的发生率，因此干预单核细胞TF表达的研究为临床冠脉病变的防治提供了一个新思路。过氧化物酶体增殖物激活型受体α（peroxisome proliferator-activated receptor-α，PPARα），和其它PPAR家族中成员（PPARγ和PPARδ）一样是配体激活的转录因子，属于核激素受体超家族［3］。PPARα可以被非诺贝特（fenofibrate）或WY14643激活［4］。既往的研究集中在PPARα参与脂肪代谢和脂肪酸氧化的基因调控，近年来对PPARα激动剂在血管细胞的抗炎作用中的研究受到关注。近期的临床实践证实，贝特酸类药物（PPARα激动剂）可以减少粥样硬化病变的血栓并发症发生率［5］。本实验检测PPARα激动剂——非诺贝特是否能减少LPS诱导的THP-1细胞中TF的表达，以探讨非诺贝特对动脉粥样硬化血栓并发症的治疗作用机制。材料和方法材料细胞来源THP-1为人源单核细胞白血病细胞系，购自武汉大学。主要试剂M199培养液、胎牛血清(Hyclon公司产品)。LPS（Sigma公司产品）。RT-PCR kit（Toyobo公司产品），TRIZOL试剂（上海华舜生物公司产品），TF以及TFPI单克隆抗体（HTI公司产品），羊抗小鼠抗体（北京中山公司产品），非诺贝特（法国利博福尼公司产品）。方法细胞培养THP-1单核细胞悬浮于M199培养液(含10%胎牛血清)，在37℃、5%CO2条件下培养。THP-1细胞分别给以不同浓度的PPARα激动剂—非诺贝特（0、10、50和100μmol/L），然后加入LPS（100μmol/L）作用一定时间。LPS的浓度根据预实验确定。用台盼蓝检测细胞活力。THP-1细胞TF mRNA表达的RT-PCR检测按照试剂说明书用TRIZOL提取THP-1细胞总RNA，用RT-PCR kit进行反转录，TF上游引物序列5’-GCTAGTATTATGGGCGTGAA-3’;下游引物序列,5’-GAATACCAATGTCTCCTGCA-3’。内参照β-actin上游引物序列5’-GCCGGACTCGTCATACTCCT-3’;下游引物序列5’-ATGCCATCCTGCGTCTGGA-3’。扩增按照下列条件进行：94℃预变性5分钟，进行以下循环：94℃30秒，50℃30秒，72℃45秒，共30个循环，最后72℃延伸5分钟。扩增产物用琼脂糖电泳，溴化乙锭显色。内参照β-actin评价反应产物。THP-1细胞TF蛋白表达的Western blot检测用冰PBS洗细胞后溶于0.2 ml冰悬浮缓冲液（0.1 mol/L NaCl,0.01 mol/L Tris/HCl,pH 7.6,0.001 mol/L EDTA,pH 8.0,100μg/ml PMSF,1μg/ml aprotinin）中，用DC Protein Assay kit进行总蛋白定量，蛋白上样，10%SDS-PAGE分离蛋白，转至硝酸纤维素滤膜上。含5%脱脂奶粉的封闭液4℃过夜。一抗于37℃孵育1小时，分别用PBS和TBS洗3次，二抗于37℃孵育1小时。ECL法检测蛋白质表达。同样方法测定TFPI蛋白量。统计学处理所有数据采用±SD表示，数据分析处理用SPSS 11.0软件。不同浓度非诺贝特处理组及对照组间比较采用one-way ANOVA分析，P<0.05为统计学差异显著。结果THP-1中TF mRNA水平和TFPI mRNA水平变化检测结果见图1、2和表1，2。LPS预刺激2小时后可见到细胞有TF表达。与对照组比较，10、50和100μmol/L非诺贝特处理的细胞TF mRNA水平降低（P<0.01），呈现浓度依赖性。但是内源性TF活性的抑制物-组织因子途径抑制物（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）的mRNA水平在各组中没有检测到显著差异（P>0.05）。Table 1.Effect of fenofibrate on TF mRNA and protein expression（略）THP-1中TF蛋白和TFPI蛋白表达水平变化无LPS刺激时，未见单核细胞有TF的蛋白表达。单纯100μmol/L LPS刺激后可见THP-1有较多TF蛋白表达（光密度积分比值0.96±0.09），浓度大于10μmol/L的各组非诺贝特抑制了由LPS诱导的单核细胞THP-1的TF蛋白表达（0.42±0.08，0.58±0.06，0.74±0.06，P<0.01），呈现浓度依赖性（图3，表1），但非诺贝特对TFPI的蛋白表达没有作用（P>0.05）（表2）。Table 2.Effect of fenofibrate on TFPI mRNA and protein expression（略）讨论本实验证实PPARα激动剂——非诺贝特下调LPS诱导的THP-1细胞中TF mRNA和蛋白表达，但是对TFPI无影响。实验结果首次提示PPARα的激活在其调控动脉粥样硬化血栓形成中的可能作用。我们证实，未经诱导的THP-1单核细胞无TF mRNA和蛋白表达，LPS可以诱导THP-1细胞表达TF。用非诺贝特预处理单核细胞可以抑制LPS诱导的TF mRNA和蛋白表达，但是没有观察到非诺贝特对TFPI的mRNA及蛋白表达有抑制作用，说明非诺贝特对TF启动的凝血途径具有抑制作用，并且这种抑制作用不是通过影响TF的内源性抑制物-TFPI的合成来实现的，而是对TF mRNA和蛋白表达直接发挥抑制作用。PPARα激动剂抑制动脉粥样硬化进程已经在临床实践中得到证实。PPARα可能在不同程度上干预动脉粥样硬化进程的途径大致有以下几方面：首先PPARα可通过改变血浆脂质和脂蛋白水平来降低粥样硬化形成的病变程度；其次PPARα可以通过抑制血管壁的炎性反应减轻粥样硬化进程［6,7］；还有PPARα可以抑制TNFα诱导的VCAM-1在内皮细胞的表达，以影响单核细胞的募集，减轻粥样硬化病变的发展［8］。此外，PPARα还可以诱导活化的巨噬细胞凋亡，以影响粥样硬化性进程的后期阶段［9］。本实验结果表明，PPARα的活化抑制了作为主要血栓形成启动因素的TF表达。TF除了可以引起血栓形成，也还可以介导单核细胞的黏附和迁移，因此抑制了TF的表达，成为PPARα激动剂抑制粥样硬化进程的又一可能途径，这与以往的研究结果一致［10］。本研究已经显示PPARα激动剂抑制了由炎性刺激物LPS诱导的TF表达。LPS诱导TF mRNA表达是经Jun磷酸化和NF-kB易位的瞬时方式实现的［11］。PPARα阻遏c-Jun和p65的转录活性，从而抑制促炎性反应的AP-1和NF-kB信号途径。因为这些转录因子也参与了TF转录调控，PPARα调节TF表达也就可能是通过抑制AP-1和/或NF-kB的激活途径来实现。进一步的研究应探讨PPARα激活物是否经PPARα和转录因子（Jun-Fos和NF-kB）的相互作用来抑制TF的基因表达。总之，PPARα激动剂非诺贝特抑制了由LPS刺激THP-1细胞引起的TF表达上调作用。PPARα激动剂对单核细胞的这种作用提示了其通过影响动脉粥样硬化斑块进程以及血栓形成而发挥对粥样硬化的治疗作用。使用粥样硬化的动物模型进行在体实验可能进一步说明PPARα可否经降低TF表达来减少动脉粥样硬化斑块的血栓形成。【参考文献】1 Rapaport SI,Rao LV.Initiation and regulation of tissue factor-dependent blood coagulation.Arterioscler Thromb,1992;12:1111-1121 2 Ardissino D,Merlini PA,Ariens R,et al.Tissue-factor antigen and activity in human coronary atherosclerotic plaques.Lancet,1997;349（9054）:769-771 3 Schoonjans K,Martin G,Staels B,et al.Peroxisome proliferator-activated receptors,orphans with ligands and functions.Curr Opin Li-pidol,1997;8:159-166 4 Forman BM,Chen J,Evans RM.Hypolipidemic drugs,polyunsaturated fatty acids,and eicosanoids are ligands for peroxisome proliferator-activated receptors alpha and delta.Proc Natl Acad Sci USA,1997;94:4312-4317 5 Tenenbaum A,Motro M,Fisman EZ,et al.Bezafibrate for the se-condary prevention of myocardial infarction in patients with metabolic syndrome.Arch Intem Med,2005;165:1154-1160 6 Staels B,Koenig W,Habib A,et al.Activation of human aortic smooth-muscle cells is inhibited by PPARalpha but not by PPARgamma activators.Nature,1998;393:790-793 7 Ye P,Li JJ,Su G,et al.Effects of fenofibrate on inflammatory cytokines and blood pressure in patients with hypertriglyceridemia.Clin Chim Acta,2005;356:229-232 8 Marx N,Sukhova GK,Collins T,et al.PPARalpha-activators inhibit cytokine-induced vascular cell adhesion molecule-1 expression in human endothelial cells.Circulation,1999;99:3125-3131 9 Chinetti G,Griglio S,Antonucci M,et al.Activation of proliferator-activated receptorsαandγinduces apoptosis of human monocyte-derived macrophages.J Biol Chem,1998;273:25573-25580 10van-Raalte DH,Li M,Pritchard PH,et al.Peroxisome proliferator-activated receptor(PPAR)-alpha:a pharmacological target with a promising future.Pharm Res,2004;21:1531-1538 11 Hall AJ,Vos HL,Bertina RM.Lipopolysaccharide induction of tissue factor in THP-1 cells involves Jun protein phosphorylation and nuclear factor kappaB nuclear translocation.J Biol Chem,1999;274:376-383。