非小细胞肺癌患者外周血DC亚型与 NK细胞的关系论文.doc

会员专享推荐 · 你可能也用得上更多

开通会员，畅读全站文档

本篇文档已为你保留

本篇文档价值 ~~¥35.00~~会员免费解锁

全文不限次阅读，剩余内容即刻解锁
高速下载通道，免排队、无等待
专属客服 1 对 1 答疑，优先响应
每日赠送下载券，本篇文档免费送

有 86 篇商业计划书正在上传

下载原文档

非小细胞肺癌患者外周血DC亚型与NK细胞的关系论文【摘要】目的探讨非小细胞肺癌患者外周血树突状细胞亚群（dc1/dc2）和机体nk细胞含量之间的关系及其临床意义。方法采用流式细胞术检测40例肺癌患者外周血dc亚群（cd11c+dc/dc1和cd123+dc／dc2）、nk细胞含量及血浆il12的浓度，并以10例健康受试者作为对照。结果肺癌患者外周血cd11c+dc百分率为（0.66±0.24）％，比对照组（1.38±0.18）％明显降低（p<0.01），cd123+dc百分率（0.28±0.17）％与对照组（0.27±0.11）％相比，差异无统计学意义（p＞0.05）；肺癌患者与健康人比较，nk细胞含量及il12的浓度均降低（p<0.05）。nsclc患者nk细胞的含量与cd11c+百分数及血浆il12浓度均呈正相关（p<0.05），与cd123+百分数呈负相关（p<0.01）。dc各亚型百分率同患者的卡氏评分、化疗史有关联（p<0.01），nk细胞的含量与年龄相关（p<0.05）。结论非小细胞肺癌患者dc1功能低下，il12分泌能力障碍，从而影响了nk细胞的活性。dc亚型与nk细胞含量之间以及它们与临床生物学行为之间都有一定关系。【关键词】肺癌树突状细胞亚群自然杀伤细胞树突状细胞（dendritic cell，dc）是一种专职的抗原提呈细胞，依据dc起源和功能，将人外周血dc分为两个亚群[14]。.133229.CoM自然杀伤（nature killer，nk）细胞在机体免疫中地位重要，外周血nk细胞的变化是反映机体细胞免疫状态的重要指标[5]。晚期非小细胞肺癌患者dc亚群的表达水平如何，它同患者机体nk细胞的关系如何，以及此二者同步检测的临床意义究竟如何，目前尚无定论。本研究对40例晚期非小细胞肺癌患者的dc亚群和机体免疫状态进行了同步检测和分析，现总结报告如下。1.1病例选择收集符合纳入标准的非小细胞肺癌患者40例，对照组10例，均为健康受试者。1.1.1纳入标准（1）有明确病理诊断的iii～iv期非小细胞肺癌患者；（2）心、肝、肾和造血系统功能基本正常；（3）预计生存期在6个月以上；（4）karnofsky评分≥60分。1.1.2排除标准（1）无明确病理诊断者；（2）预期生存期<6个月者；（3）合并有心、肝、肾和造血系统等严重疾病；（4）儿童、孕妇和精神病患者。1.2一般资料按照上述条件共纳入40名患者，均为我科xx年8月～xx年12月期间的住院病人。其中男27例，女13例；年龄38～82岁，中位年龄63岁；iii期15例，iv期25例；病理类型：腺癌23例，鳞癌17例。1.3试剂与仪器免疫荧光三标记dc检测试剂盒（3瞔olor dendritic value bundle）购自美国becton dickson公司，内有fitc标记的lineage cocktail 1（lin1），由cd3、cd14、cd16、cd19、cd20、cd56系列抗原混合单抗组成，cd11c瞤e、cd123（抗il3r）pe，抗hla瞕r瞤ercp及阴性同型对照小鼠igg1瞤e/igg2瞤e；fitc或pe标记鼠抗人cd3-并cd16/cd56+单克隆抗体，facs calibur流式细胞仪（美国becton dickson公司生产），离心机等。1.4测定指标与方法1.4.1外周血dc1/dc2亚型的检测参考文献[6]，取肝素抗凝外周血500μl，分装4管，每管100μl全血，加入lin1、抗hla瞕r瞤ercp、cd123（抗il3r）pe、cd11c瞤e及阴性对照igg1瞤e/igg2瞤e单抗，振荡混匀，室温暗处反应15min，加入2ml溶血素，混匀、裂解10min，离心弃上清，洗涤1次，加入300μl的１％多聚甲醛溶液，用facs calibur流式细胞仪每管收集50000个细胞，fsc设阈值，排除碎片干扰，用cell quest软件获取及分析hla瞕r／lin1点图中的hla瞕r阳性、lin 1弱阳性和阴性的细胞群体，以cd11c和cd123荧光抗体染色阳性细胞百分率记录结果。1.4.2 nk细胞的检测参考文献[7]，用fitc或pe标记鼠抗人cd3-并cd16/cd56+单克隆抗体，由流式细胞仪测定外周血中nk细胞含量。1.4.3血浆il12浓度检测按照il12试剂盒的操作说明进行：于96孔酶标板中每孔加入assay diluent rdif 50μl，各孔中分别加入已配制的il12标准液或已经室温融化并离心的血浆样本200μl，室温静置2h，弃上清液并用washer buffer洗涤3次，各孔中加入200μl il12结合物，室温静置2h，弃上清液并用washer buffer洗涤3次，加入200μ1底物溶液，室温避光静置20min，加入50μl终止液，静置25min后上酶标仪(450nm)读取od值，绘制标准曲线并求出各标本的血浆il12浓度。1.5统计学方法应用spss13.0统计分析软件对实验数据进行统计，采用两样本均数差别的秩和检验、双变量相关分析及偏相关分析。2.1外周血中树突状细胞亚型的检测肺癌患者外周血髓系树突状细胞（mdc，cd11c+）的表达与正常对照组比较显著降低（p<0.01），淋巴系树突状细胞(ldc，cd123+)的表达与正常对照组比较差异无统计学意义（p>0.05），见图1、表1。表1肺癌患者与健康对照组外周血树突状细胞亚型的检测结果2.2外周血中nk细胞活性及血浆il12浓度的检测检测结果显示，nsclc患者血浆il12浓度为（3.19±0.30）pg/ml，显著低于正常人（8.21±1.80）pg/ml(p=0.000)。nsclc患者与健康人比较，nk细胞的杀伤能力减弱，其含量为（15.51±2.15）％，低于健康对照组的（22.53±15.25）％（p=0.018），见图2、表2。2.3 nsclc患者树突状细胞亚型、il12及nk细胞的含量之间相关性分析对nsclc患者外周血中cd11c+、cd123+百在fsc vs ssc散点图中划出单个核细胞区r1，然后将lin1表达阴性细胞设为r2（排除t、b、nk等细胞），再将hla-dr+cd11c+或hla-dr+cd123+设为r3（mdc或pdc）图1 dc亚型流式细胞图在fsc vs ssc散点图中划出淋巴细胞区r1，其中cd3-/cd16＋cd56+者即为nk细胞图2 nk细胞流式细胞图分数与il12、nk细胞的含量进行相关性分析，见表3。结果显示，nsclc患者血浆il12浓度同cd11c+百分数呈正相关（p<0.05）；nk细胞的含量与cd11c+百分数呈正相关（p<0.05），而与cd123+百分数呈负相关（p<0.01）。而nsclc患者血浆il12浓度同nk细胞的含量之间亦有关联性，即两者呈正相关（p<0.01）。表2肺癌患者与健康对照组外周血中nk细胞含量及t细胞亚群的检测结果表3 40例肺癌患者树突状细胞亚型与外周血il12、nk细胞含量之间的相关性表4 40例肺癌患者树突状细胞亚型与临床病理特征的关系2.4肺癌患者树突状细胞亚型、nk细胞含量与临床病理特征分析的关系肺癌患者树突状细胞亚型、nk细胞含量与临床病理特征的关系，见表4。按照卡氏评分（<80vs≥80）、化疗史（有vs无）分组，cd11c+dc百分数有极其显著性差异（p<0.01），cd123+dc百分数有显著性差异（p<0.05）；按照病理类型（腺癌vs鳞癌）分组cd11c+dc百分数差异有统计学意义（p<0.05）；其余分组（性别、年龄、临床分期）之间的各dc亚型百分数比较差异均无统计学意义。而nk细胞的含量仅与年龄相关（p<0.05），同其他临床特征无明显关联（p>0.05）。3.1肺癌患者dc亚型的特征树突状细胞（dc）是一种专职的抗原提呈细胞，依据dc起源和功能，将人外周血dc分为两个亚群：dc1亚群为髓样细胞（myeloid dc），它以cd11c+dc前体形式存在于外周血中，在炎症刺激时分化为成熟的cd11c+dc，产生白细胞介素il12，促进th1应答；dc2亚群为淋巴样细胞（lymphoid dc），由其cd123+dc前体细胞加il3诱导后分化为成熟的淋巴样dc，不产生il12，诱导th2应答。新鲜分离的外周血dc缺乏树枝状的形态学特征，其表面均弱表达或不表达单核细胞、淋巴细胞、嗜酸粒细胞、中性粒细胞及天然杀伤细胞的标记抗原，但高表达hla瞕r抗原。因此，将淋巴细胞系列抗原（lin1：cd3、cd14、cd16、cd19、cd20、cd56的混合体）表达阴性或弱阳性，hla瞕r表达阳性来初步界定dc群，再根据cd11c和cd123的表达来确定分别为cd11c+dc/dc1和cd123+dc/dc2。本次的实验结果表明：肺癌患者外周血cd11c+dc/dc1在白细胞中所占比例低于正常人（p=0.000），而cd123+dc/dc2在白细胞中所占比例与正常人无显著差异（p=0.829），且cd11c+dc/dc1在数量上比cd123+dc/dc2占优势，说明肺癌患者dc递呈抗原水平低于正常人，提示肺癌患者机体免疫功能受损，难以促使未成熟dc向mdc分化，不能有效地通过细胞免疫途径杀伤体内的肺癌细胞；而ldc无明显增多，即th2型反应无明显增强，说明体内针对肺癌细胞的体液免疫应答无明显增强。3.2肺癌患者dc亚型与nk细胞的关系树突状细胞（dc）和自然杀伤（nk）细胞是自身免疫系统的两种独特成分，在免疫调节和适应性免疫反应的建立过程中起关键性作用。nk细胞主要通过细胞毒性效应以及产生细胞因子起作用，而dc则识别病原体并向适应性免疫系统发出警报。nk细胞是自体免疫系统中主要的淋巴细胞，通过其细胞因子产物溶解细胞，在免疫监视、免疫防御中起着十分重要的作用，具有体外杀伤肿瘤细胞的功能。研究表明，dc瞡k细胞相互作用可导致细胞激活、成熟甚至死亡。fernandez等[8]的早期研究通过证明dc激活nk细胞抗肿瘤活性，首先证实了体内dc瞡k细胞的相互作用。体外研究表明，nk细胞和成熟dc的接触导致两种细胞的激活和细胞因子的产生，包括nk细胞增殖和dc成熟[911]。dc可以通过各种机制提高nk细胞的生存率，增加nk细胞活性和分化。其中重要的机制之一就是dc分泌的细胞因子，如il12。il12曾一度被称为自然杀伤细胞刺激因子或细胞毒性淋巴细胞分化因子，人体内的dc1可通过分泌il12，促进thl反应，诱导细胞免疫，而il12又可促进dc1的分化、成熟。事实上，人体内的dc能更好地支持nk细胞的存活[12]。成熟的dc还是il12的主要，il12可以增加nk细胞介导的细胞毒性和ifn拨貌生[13]。本研究结果显示nsclc患者外周血mdc含量及血浆il12降低，说明nsclc状态下外周血mdc存在il12分泌能力的障碍，从而影响了nk细胞的活性。提示nsclc患者体内不仅存在mdc数量的减少，而且存在nk细胞功能上的缺陷。nsclc患者体内dc产生和功能上的缺陷是肿瘤细胞逃脱机体监视的重要机制之一。另外，检测结果显示，随着cd123+dc/dc2的百分含量下降，肺癌患者nk细胞含量增高（p=0.018），两者呈显著负相关。本试验证实，dc瞡k之间的相互作用和通讯，构成了一个正反馈环路，一旦2种细胞中的任何一种细胞感受到了“危险”或组织损伤发生，这一环路将被激活。dc瞡k细胞之间的相互作用是接触依赖型的，但也同时包括细胞因子之间的交互作用。3.3 dc亚型与nk细胞之间关系分析的临床意义由此可见，dc亚型分布情况、nk细胞含量在判断非小细胞肺癌患者病情发展上有一定的临床意义，它们同卡氏评分、是否化疗等临床特征之间均有十分密切的关系。所以，当肺癌发生时，宿主的dc亚群及nk细胞的功能低下、比例失调，导致机体免疫平衡失调。随着肿瘤患者病情的发展，肿瘤某些生物学特征（机体免疫状态和其他一些生物学指标等）同时发生一些变化，进而提示这些指标之间有一定的相关性。本组研究表明，晚期非小细胞肺癌患者在接受化疗过程中，随着卡氏评分的逐渐降低，机体免疫功能逐渐下降，与此同时，dc各亚型的百分比也明显下降；提示肺癌患者外周血dc亚型与机体免疫状态之间有一种间接的相关性。［1］dinicola m,lomoli rm.dendritic cells:specialized antigen presenting cells[j].haematoltgica,2000，85（2）：202207.[2]ferraris,malugani f,rorati c,et al.flow cytometric analysis of circulating dendtitic cell subsets and intracellar cytokine production in advanced breast cancer patients[j].oncol rep,xx,14(1):113120.[3]hideo h,takahiro h，hiroaki y,et al.partmental imbalance and aberrant immune function of blood cd123(plasmacytoid)and cd11c(myeloid)dendritic cells in atopic dermatitis[j].j immumol,xx,174(4):23962403.[4]perrot i,blanchard d,freymond n,et al.dendritic cells infiltrating human non瞫mall lung cancer are blocked at immature[j].j immumol,xx,178(5):27632769.[5]朱迅.免疫学新进展[m].北京：人民卫生出版社，xx.207251.[6]王建中.临床流式细胞分析[m].上海：上海科学技术出版社，xx.569576.[7]时光利，岳思东，胡秀玲,等,肺癌患者外周血t淋巴细胞及nk细胞检测[j].中国实用医学，xx，4（8）：910.[8]fernandez nc,lozier a,flament c,et al.dendritic cells directly trigger nk cell functions:cross瞭alk relevant in innate anti瞭umor immune responses in vivo[j].nat med,1999,5(4):405411.[9]gerosa f,baldani guerra b,nisii c,et al.reciprocal activating inter action between natural killer cells and dendritic cells[j].j expmed,xx,195(3):327333.[10]piioli d,sbrana s,melandri e,et al.contact dependent stimulation and inhibition of dendritic cells by natural killer cells[j].j exp med,xx,195(3):335341.[11]moretta l,ferlazzo g,mingari mc,et al.human natural killer cell function and their interactions with dendritic cells[j].vaine,xx,21(2):3842.[12]valteau coua d,leboulaire c,maincent k,et al.dendritic cells for nk/lak activation:rationale for multicellular immunotherapy in neuroblastom a patients[j].blood,xx,100(7):25542561.[13]granui f,zanoni i,pavelka n,et al.a contribution of mouse dendritic cell瞕erived il2 for nk cell activation[j].j exp med,xx,200(3):287295.