大肠杆菌耐药性及其耐药基因探讨论文大肠杆菌耐药性及其耐药基因探讨论文预读:摘要：１随着海洋环境与资源的不断开发与利用,海洋也逐步成为耐药性微生物及其耐药基因的重要储存库.耐药细菌也会随雨水冲刷、潮汐和海流带入近岸海滨旅游区,通过菌种间遗传物质的传递,耐药基因有可能被传入海水环境中的人体病原菌.由于海滩娱乐水域承载了大量的游客,这些耐药性致病菌可通过海水吞咽引发游泳人群致命性肠道疾病,因而大大增加了人体耐药病原菌病害发生和流行的可能性.大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）作为海产品及海洋环境粪便污染的重要指示微生物,是临床上引起感染最常见的肠杆菌科细菌之一,致病性的大肠杆菌会引发严重的腹泻和败血症等疾病.２０１３年中国ＣＨＩ－ＮＥＴ细菌耐药性监测结果显示,在各大医院采集临床分离菌的８万多株菌中耐药性大肠杆菌的检出率最高.作为引起人类感染最常见的肠杆菌科细菌,大肠杆菌也是耐药基因的主要储存库,在耐药基因的传播中发挥着重要作用.此外,临床上发现,大肠杆菌的多重耐性现象较严重,并且多重耐药性的大肠杆菌已被发现于近岸海水中.耐药性大肠杆菌及其耐药性基因会通过海产品或海水吞咽等途径传递给人类,使抗菌药对人类疾病的治疗效果下降或消失,成为威胁人类健康的重大公共卫生问题.目前,国外仅有少数关于海水浴场中大肠杆菌耐药性的报道,如Ｔｕｒｇｅｏｎ等人通过检测比较２００４年与２００５年在魁北克南部近２００个浴场中采集的海水样品发现海水浴场中耐药性大肠杆菌的检出率升高了１０％.国内仅在北黄海近岸海域开展了抗磺胺类大肠杆菌的分布调查,并且采用的是化学分析方法,而对娱乐海水浴场中耐药性大肠杆菌的研究还未见报道.此外,目前国外的研究仅局限于海水浴场中大肠杆菌耐药性状况的检测层面,对其在海水浴场中的传播扩散因子———耐药基因的分布研究尚未开展.因此,我们对大连星海浴场中大肠杆菌耐药性及其耐药基因进行研究,通过药敏实验分析了海水浴场中大肠杆菌的耐药性状况,根据抗生素敏感性检测结果采用ＰＣＲ方法对受试大肠杆菌四环素耐药基因进行分析.本研究的开展将有助于了解娱乐海水对人体健康的影响,并为相关管理部门进行的海水浴场风险评价提供数据支持,对浴场中耐药基因污染的深入研究具有重要意义.２材料与方法２．１材料２．１．１样品采集于２０１４年８月进行样品采集,水样采自大连星海浴场距岸边约３０ｍ游泳人群密集处,无菌玻璃瓶采集表层（１０～１５ｃｍ）海水,低温保存运至实验室.２．１．２抗生素及生化鉴定管选取临床上治疗大肠杆菌感染常用的９种抗生素:四环素（ＴＣＹ）、哌拉西林（ＰＩＰ）、氨曲南（ＡＴＭ）、左氧氟沙星（ＬＹＸ）、头孢噻吩（ＣＥＰ）、复方新诺明（ＳＸＴ）、链霉素（ＳＴＲ）、庆大霉素（ＧＥＮ）、氯霉素（ＣＨＬ）,这９种抗生素均购自杭州天和微生物试剂有限公司.实验中所选肠杆菌科细菌生化编码微量鉴定管及参照的肠杆菌科细菌生化编码鉴定手册由杭州天和微生物试剂有限公司提供.２．１．３菌株及培养基实验用大肠杆菌质控菌株为标准菌株大肠杆菌ＡＴＣＣ２５９２２,购自广东环凯微生物科技有限公司.实验所需的培养基有４种:ｍ－ＴＥＣ,用于大肠杆菌分离培养；ＬＢ琼脂,用于菌种的纯化；ＥＣ肉汤,用于大肠杆菌生化鉴定；水解酪蛋白琼脂（Ｍｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ,ＭＨ）,用于药敏实验.２．２大肠杆菌的分离鉴定２．２．１大肠杆菌的分离使用滤膜法对大连星海浴场表层海水中的大肠杆菌进行过滤,水样过滤后滤膜置于ｍ－ＴＥＣ琼脂培养基上,于（３５±１）℃培养２ｈ,再以（４４．５±０．５）℃培养１６～１８ｈ.挑取黄色和黄棕色菌落初步鉴定为疑似大肠杆菌.于ＬＢ琼脂培养基上划线分离纯化.３７℃培养过夜,直至平板上长出单一相同的菌落.２．２．２生理生化鉴定用接种针在ＬＢ琼脂培养基上挑取单菌落,接种于肠杆菌科细菌生化编码微量鉴定管,进行以下１５种试验项目:硫化氢实验、苯丙酸盐实验、葡萄糖酸盐实验、吲哚实验、葡磷胨水实验、枸橼酸盐实验、尿素实验、半固体实验、葡萄糖产气实验、赖氨酸实验、鸟氨酸实验、棉子糖实验、山梨醇实验、侧金盏花醇实验、木胶糖实验.将鉴定管置于３７℃恒温培养２４ｈ后,依据生化反应结果,参照细菌鉴定编码册进行判断并编码,再按照编码值检索生化编码表,即可获得对应的结果.２．３抗生素敏感性检测采用ＣＬＳＩ推荐的Ｋ－Ｂ药敏纸片扩散法研究大肠杆菌对９种常用抗生素的耐药性.细菌药敏实验结果参照ＣＬＳＩ公布的标准以敏感、中敏、耐药３种形式对抑菌圈大小作出解释.采用ＵＨＯＮＥＴ５．６软件对药敏结果进行分析.抗生素敏感性检测过程中采用大肠杆菌ＡＴＣＣ２５９２２作为质控菌株.２．４四环素耐药基因检测为检测大肠杆菌中四环素耐药基因的分布,选取海水环境中常见的６种四环素耐药基因（ｔｅｔＡ,ｔｅｔＢ,ｔｅｔＣ,ｔｅｔＤ,ｔｅｔＥ,ｔｅｔＧ）为检测对象,以大肠杆菌基因组ＤＮＡ和质粒ＤＮＡ为模板进行四环素耐药基因的ＰＣＲ扩增.ＰＣＲ反应条件及引物信息参照文献［１３］.２５μＬ的ＰＣＲ反应体系:２×ＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ１２．５μＬ,上下游引物各０．２５μＬ,ＤＮＡ模板１μＬ,ｄｄＨ２Ｏ１１μＬ.基因组ＤＮＡ和质粒ＤＮＡ的提取均参照试剂盒（天根生物公司的基因组ＤＮＡ和质粒ＤＮＡ提取试剂盒）说明书.２．５统计学分析应用ＳＰＳＳ软件,根据对大肠杆菌分离菌株体外四环素药物敏感性和四环素耐药基因ＰＣＲ检测结果,将四环素耐药基因阳性菌株数与四环素耐药菌株数进行χ２检验,对四环素耐药基因阳性菌株中的耐四环素菌株数与四环素耐药基因阴性菌株数进行比较,分析大肠杆菌的四环素耐药性与四环素耐药基因阳性检出率的相关性.３结果３．１生理生化鉴定对在ｍ－ＴＥＣ琼脂培养基上初筛得到的１３８株疑似大肠杆菌菌株进行生理生化鉴定,结果如表１所示.由表１可知,其中４１株为大肠杆菌,分离率为３０％,其余７７株为非肠杆菌科细菌.这说明使用ｍ－ＴＥＣ琼脂培养基应用于海水中大肠杆菌的分离率较低.３．２药敏实验４１株大肠杆菌对９种常用抗生素的药敏实验结果显示,６６％的受试大肠杆菌被检测到耐药性.其中受试菌株对四环素的耐药率最高（４６％）,对头孢噻吩和复方新诺明也呈现较高耐药性,耐药率达到３０％以上.受试菌株对哌拉西林、左氧氟沙星、链霉素、庆大霉素和氯霉素的耐药率也达到了近２０％.而对氨曲南耐药率最低（５％）（表２）.４１株大肠杆菌的多重耐药率为３４％,最高耐抗生素个数达到７（表３）.３．３四环素耐药基因的ＰＣＲ检测３．３．１基因组ＤＮＡ中四环素耐药基因检测采用ＰＣＲ方法对４１株大肠杆菌基因组ＤＮＡ中的四环素耐药基因ｔｅｔ（Ａ,Ｂ,Ｃ,Ｄ,Ｅ,Ｇ）进行检测,结果显示,仅耐药基因ｔｅｔＡ和ｔｅｔＢ被检测到,检出率分别为３４％和２％（表４）.四环素耐药菌株中１４株（６３％）检测到ｔｅｔＡ基因,１株（５％）检测到ｔｅｔＢ基因,２株四环素敏感菌株检测到ｔｅｔＡ基因,推测其原因为携带四环素耐药基因但并未表达.其他四环素耐药基因检测结果均为阴性.实验结果中四环素耐药基因检测结果为阳性的菌株,四环素耐药菌株占了很大比率,ｔｅｔＡ检测为阳性的菌株中８６％为四环素耐药菌株,ｔｅｔＢ检测为阳性的菌株中１００％为四环素耐药菌株,这表明四环素耐药基因在基因组ＤＮＡ中的携带情况与耐药菌株的四环素耐药表型可能存在一定的相关性.３．３．２质粒ＤＮＡ中四环素耐药基因检测大肠杆菌质粒ＤＮＡ中四环素耐药基因检测结果显示,４１株受试大肠杆菌中ｔｅｔＡ的检出率为２９％,而ｔｅｔＢ的检出率为１２％.四环素耐药基因ｔｅｔＡ阳性菌株中９１％为四环素耐药菌株,ｔｅｔＢ阳性菌株中全部为四环素耐药菌株（表５）,这说明四环素耐药基因在质粒ＤＮＡ中的携带情况与耐药菌株的四环素耐药表型存在一定的相关性.３．３．３四环素耐药表型与四环素耐药基因的相关性分析４１株分离菌株中,有１９株为四环素耐药菌株,耐药率为４６％.大肠杆菌基因组ＤＮＡ与质粒ＤＮＡ中四环素耐药基因的检测结果显示,四环素耐药基因阳性菌株中四环素耐药菌株所占比例较高,分别为８６．７％和９４．１％.为进一步验证四环素耐药基因阳性菌株数与四环素耐药菌株数之间的相关性,将二者进行χ２检验,发现四环素耐药基因阳性菌株中的四环素耐药菌株数显著高于四环素耐药基因阴性菌株,表明大肠杆菌的四环素耐药性与四环素耐药基因阳性检出率相关.４讨论本文采用ｍ－ＴＥＣ琼脂培养基在大连星海浴场海水中初筛获得１３８株疑似大肠杆菌,经生理生化鉴定发现４１株分离菌株为大肠杆菌,这说明应用于ｍ－ＴＥＣ琼脂培养基方法对海水中大肠杆菌的分离率较低.药敏试验结果显示,６６％的受试大肠杆菌被检测到耐药性,受试大肠杆菌对９种抗生素中四环素的耐药率最高.这可能与四环素类药物（包括四环素、土霉素、金霉素、强力霉素等）在我国使用时间较长,应用范围较广有关.相反,由于氨曲南等药物的临床使用相对较少,在药物使用的选择压力下,反映为抗生素的耐药率相对较低,这与国外的相关研究结果一致.如在印度东南部杜蒂戈林海岸的海洋生物中筛选出的１６８株大肠杆菌中,其中对四环素的耐药率达到了２６％；韩国学者对ＧＯＭＳＯ海湾表层海水中筛选出的１３１株大肠杆菌进行耐药性研究发现,四环素耐药率为３３．６％、链霉素１１．５％、氯霉素９．９％、庆大霉素０．８％.本研究发现大连星海浴场海水中大肠杆菌不但普遍存在抗生素抗性,而且其多重耐药率较高,这说明星海浴场中多重耐药情况明显,而多重耐药的产生会给人和动物疾病的治疗带来极大困难,因此海水浴场水质相关管理部门应引起重视.在本研究中,大肠杆菌对四环素的耐药性最为普遍,为进一步了解我国海水浴场海水中大肠杆菌四环素耐药性传播机制,本文初步研究了大肠杆菌中四环素耐药基因的分布.前期研究发现,海水环境中的细菌至少有７种以上不同质粒编码的四环素耐药基因（ｔｅｔＡ,ｔｅｔＢ,ｔｅｔＣ,ｔｅｔＤ,ｔｅｔＥ,ｔｅｔＧ,ｔｅｔＹ等）,并且世界上不同海域内主要四环素耐药基因的种类和组成有很大的差异,这种差异不但与地理分布有关,而且还与细菌耐药性的进化有关.普遍认为主动外排作用和核糖体保护作用是细菌对四环素产生耐药性的主要机制,其中大肠杆菌以主动外排机制为主［２０］,研究较多的主动外排基因分别为ｔｅｔＡ,ｔｅｔＢ和ｔｅｔＣ等,其中ｔｅｔＡ与ｔｅｔＣ作为代表四环素类药物外排机制的基因广泛存在于很多细菌中.本研究发现受试大肠杆菌无论是基因组ＤＮＡ还是质粒ＤＮＡ中仅四环素耐药基因ｔｅｔＡ和ｔｅｔＢ被检测到,而且ｔｅｔＡ的检出率最高,因此推测海水浴场海水中大肠杆菌四环素耐药性可能主要由ｔｅｔＡ基因传递,主动外排机制可能为本研究中试验菌株四环素耐药的主要机制.ＦａｎＷ等［２２］在世界范围内收集了１０７株耐四环素大肠杆菌分离株,用多重ＰＣＲ方法检测四环素耐药基因,结果发现其中４９．５％含ｔｅｔＡ基因,３５．５％含ｔｅｔＢ基因,５．６％含ｔｅｔＣ基因,１．９％含ｔｅｔＤ基因.以上数据说明ｔｅｔＡ基因和ｔｅｔＢ基因可能在大肠杆菌中分布广泛,这两种基因尤其是ｔｅｔＡ基因作为四环素外排泵基因,在四环素耐药性方面起到主要作用.通过检测四环素耐药基因还发现,四环素耐药基因检测结果为阳性的菌株在耐四环素的大肠杆菌中占了很大比率,这说明四环素耐药基因的携带情况与耐药菌株的四环素耐药表型可能存在一定的相关性.将四环素耐药基因阳性菌株数与四环素耐药菌株数进行χ２检验发现,四环素耐药基因阳性菌株中的耐四环素菌株数显著高于四环素耐药基因阴性菌株数,这表明大肠杆菌的四环素耐药表型与四环素耐药基因阳性检出率相关,因此进一步推断在本研究中大肠杆菌四环素耐药性的产生可能是由ｔｅｔＡ和ｔｅｔＢ基因介导的.５结论参考原创论文统计数据分析，本文结论认为（１）采用Ｋ－Ｂ药敏纸片扩散法研究发现,大连星海浴场表层海水中大肠杆菌耐药情况严重,其中对四环素的耐药率最高,并且多重耐药状况明显.（２）对分离的大肠杆菌进行四环素耐药基因检测发现,主动外排基因ｔｅｔＡ与ｔｅｔＢ被检测到,主动外排机制被推测为受试菌株四环素耐药的主要机制.（３）海水中受试大肠杆菌的四环素耐药表型与四环素耐药基因阳性检出率显著相关,其耐药性的产生可能是由ｔｅｔＡ和ｔｅｔＢ基因介导的.
