检验方法确认程序(共8页).doc

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检验方法确认程序一．目的：适应医学技术的发展，确保检验方法准确可靠，以满足临床需要。二．适用范围：实验室所有开展的检验方法。三.工作程序：1．实验室必须使用能保证准确和可靠的检验结果的检验方法、器材、仪器、试剂、质控品和校准品、供应品。2．必须选择能保证检给结果在实验室所确定的方法性能规格内的方法。在检测标本前，实验室必须对使用方法的下述的性能规格进行确认：准确度、精密度。如有必要，可添加特异性和分析灵敏度，以及检验结果的报告范围、参考值以及其它适合的特性。2．1．实验室引进我国注册登记的国外方法（试剂盒）或我国取得生产许可证和方法（试剂盒）时，在报告检验结果前，必须得到下列特性的性能规格：准确度、精密度、检验结果的报告范围（或者线性）、参考值。实验室至少应检查其准确度、精密度。必要时增加特异性和分析灵敏度，以及报告范围，参考值是否符合本实验室的服务人群等。如与厂商提供的数据进行比较，应取得相符结果。2．2．实验室自行建立的方法，在报告结果患者前：2．2．1建立每一方法的性能规格，包括：准确度、精密度、特异性、干扰因素的影响、分析灵敏度、检验结果的报告范围（或者线性）、参考范围、其它需要检测的性能。2．2．2．建立该方法的校准程序和ICQ规则。2．3实验室必须有上述活动的记录和文件。并保存到停止到使用这些方法后半年。3．实验室必须有与所做检验的专业和工作量相适应的，足够的器材、仪器、试剂、质控品和校准品、供应品。4．实验室必须确定正确制备、储存和使用上述体外诊断用品的条件。4．1．这些条件包括：水的质量、温度校准。保护器材和仪器，不致由于电流的波动各中断引起对检验结果的不利影响。4．2．必须将纠正由于达不到规定所采取的改正措施文件化。5．用商品试剂盒时，对于国家规定应有生产许可证，注册登记证的品种，决不能使用没有生产许可证、注册登记证的商品试剂盒。尚未规定者，生产厂家应提供该产品性能规格以及质量保证书。6．试剂、溶液、培养基、校准品、质控品和其它供应品，必须加以标记，标记上应有：6．1．识别名：当有意义时应标明浓度，效价，滴度等6．2．储存要求6．3．制备日期和失效期6．4．其它与正确使用有关的信息7．应根据仪器制造商说明或依据权威机构的要求来选择和使用校准品和质控品。实验室自行选用的校准品或质控品，应有实验依据证明其不影响检验结果的准确性和可靠性。8．当试剂、溶液、培养基、校准品、质控品或其它供应品超过其失效期，可能已经变质或者质量不合格时，不能使用。只有当生产厂家或权威机构出具书面证明或者实验室有充足依据证明其不影响检验结果的准确性和可靠性，方可在规定的延长期间使用。9．除非有生产厂家说明，不同批号试剂盒中成分不能相互交换。10．实验方法的评价10．1．准确度的评价准确度是指测定结果偏离真值的程度，它与系统误差的随机误差合成的大小相对应，，其含义乃是不准之意。在实际测量过程中，往往需要做几次平行测定。精密度是指测定结果偏离平均值的程度，常用偏差来表示：算术平均误差标准偏差其中为单次测定值，为多次测定值的平均值，n为测定次数。精密度又称精度，精度这个词也常用作泛指性的广义名词。例如：实验相对误差为0.01，则常笼统说精度为10-4。如果是由系统误差与随机误差共同引起，则可说其准确度为10-4。精密度高只是准确度高的必要条件，而不是充分条件，不能说精密度高则准确度一定高。10．2精密度评价1、精密度的内容：精密度通常用不精密度表示，精密度评价的目的是评价检测设备的总不精密度，是设备在一定时间内的变异性。许多变异源可在不同程度上影响设备的精密度，通常在进行精密度评价时要充分考虑所有影响总不精密度的来源，但不必去评价每个来源的相对大小。用于描述与时间相关的不精密度的内容包括：批内、批间、日内和日间不精密度。其中，批内不精密度和总不精密度的内容最为重要。2、一般实验要求：为减少对结果的影响因素，全部实验过程中应使用单一批号的试剂和校准物。实验样本可采用稳定化、蛋白基质、可模拟临床样本特性的产品，必要时，可采用稳定化的混合冷冻血清。选择样本浓度时应考虑医学决定水平，推荐使用2个或以上浓度的样本。3、实验程序：精密度评价实验应在操作者完全熟悉实验过程和评价方案以后（通常需要5天时间）进行。每天分2批测定样本，各批实验间至少间隔2小时。每批测定2个浓度样本，每个样本重复测定2次。按表1记录实验结果。4、结果计算（略）10．3测定线性范围评价线性是分析方法的一个特征，不同于准确度和精密度。线性范围（LinearRange）是指系统最终的输出值（浓度或活性）与被分析物的浓度或活性成比例的范围。线性范围的测量即测定浓度曲线接近直线的程度，它反映整个系统的输出特性。线性检验系统反应，包括校准、线性化技术、系数和仪器反应。一般要求：执行分析过程的实验人员必须掌握仪器操作和维护程序、样本准备方法和校准。对较简单的设备需要5天或更少的时间，对较复杂的多通道设备需要5天或更长的时间。在完成仪器熟悉过程后开始实验并收集数据。实验样本：线性实验应使用与病人样本相似的样本或注明样本的基质类型，最少使用4个浓度水平，推荐5个水平。高值样本应高于线性上限30%，低值样本应低于线性低限。线性实验可使用的样本包括：混合病人血清（理想的样本基质）、加入待测物的混合人血清（加入品在没有干扰物存在时不需高纯度）、对特殊材料透析过的混合人血清（用于降低分析物浓度，如：透析、热处理、层析）、对盐水透析过的混合血清（在线性实验中使用此类样本可掩盖不同的基质效应）。商品质控物或校准物（此类样本由于不是正常的生理形式，可掩盖实际的线性结果）、水溶液（一般无基质效应），等。实验程序：全部实验和数据采集应在同一工作日内完成。分析序列应为随机排列。有显著携带污染时，应用空白隔开样本。每个浓度样本重复测定4次。记录测定结果。结果分析：观察结果有无明显的数据错误，若有明显异常时，应判断是否为离群点。对于特定浓度Yi值的离群点进行检验时，需将其4个重复值从大到小排列（Yi-1到Yi-4）。计算极差D=Yi-1-Yi-4。若Yi-1可能是离群点，计算：D1=（Yi-1–Yi-2）/D。若Yi-4可能是离群点，计算：D4=（Yi-3–Yi-4）/D。计算结果（D1或D4）如果大于0.765(0.05)或0.889(0.01)，则该点判为离群点。全部数据中的离群点如果有2点或以上，则应保留全部数据或重新进行实验。以分析物浓度为X轴，反应值或仪器输出值为Y轴，绘制X-Y线性图。目测线性和进行统计学分析，判断是否符合要求。对于线性结果的分析，应当注意统计学标准和临床可接受限不同；应慎用方法学线性范围从0开始；有临床意义的浓度应在线性评价中，如最低线性浓度、医学决定水平及最高线性浓度。10．4．方法学比较临床实验室中使用的检验方法，随着科学技术的发展不断更新，在引进新方法前或用一种方法替代另一种方法时为保证临床实验室检验结果的连续性，通常要进行偏差分析，以比较不同的分析方法在测定同一分析项目时结果的差异。1、样本要求：用于方法学对比实验的样本，应来源于健康人或患者，无明显干扰因素，并应尽量避免使用贮存样本。全部样本在医学决定水平范围内均匀分布，样本至少40例，增加可提高可信性。2、对比方法：可采用厂家要求的实验室常规方法或公认的参考方法。对比方法应具有好的精密度，没有已知的干扰物，与评价方法单位相同，相对国家标准或参考方法的偏差为已知。3、实验程序：a)操作者应有足够的时间熟悉仪器操作，保养程序及评价方案。在全部实验过程中，都必须建立适当的质量控制程序。b)进行方法学对比实验，每天应测定8份样本，每份样本都用评价方法和对比方法进行双份测定，至少连续测定5天，共40份样本。测定时先对样本排序，再按顺序1至8测定第一次，顺序8至1测定第二次。按表3收集实验数据c)结果绘图：实验结果可绘制4张图，第一张图是Yi对Xi的均值散点图，第二张图为Yij对Xi散点图，第三张为（Yi-Xi）对Xi偏差图，第四张为（Yij-Xij）对Xi的偏差图。11．方法建立时的条件选择在方法建立的原理确定后，尚需根据其原理来选择合适的条件，以保证所建的方法可靠。下面以光度法为例介绍其条件选择的主要环节。颜色反应是光度分析的基础，因此，用作光度测定的颜色反应至少要具备以下几条：反应有较高的特异性，从而干扰小；反应产生的有色物质吸光系数要大，大者灵敏度高；有色产物的离解度要小，小则稳定；此外，还要求有色产物有恒定的组成成分，使产生的颜色稳定。由于影响颜色反应的因素很多，如温度、pH、试剂浓度、反应的时间等等。这些因素在建立新方法时都要逐项试验，确定最佳实验条件。11．1．选择合适的吸收光谱实际上就是测定颜色反应产生的光吸收曲线。方法是在整个可见光区（400-700nm）以10nm（在接近最大吸收波长范围还应再细分）间隔。分为十几个点测定其在不同波长时的吸光度，然后以吸光度为纵坐标，波长为横坐标绘成光吸收曲线。在条件许可的情况下，应采用双光束分光光度计在可见光区进行波长扫描，结果较为可靠。同时，还应以同法分别测定其空白液和标准物颜色产物的吸收曲线。测定光吸收曲线的目的是找出最大吸收波长，作为光度法波长选择的依据。因为在最大吸收波长测定，可获得最大灵敏度，且能更符合比耳定律。然而在实际使用中，不能单纯考虑灵敏度高，还要考虑在测定浓度范围能否符合比耳定律，并能在光度计准确区域内（吸光度0.2-0.85之间）读出读数。有时由于测定的最大吸收波长并不是所要测定物质的特性吸收波长，即同时存在具有相似最大吸收的干扰物质，为了保证实验的特异性，常改用特有而非最大吸收波长进行测定。例如用磷钼酸测定血糖，选用波长420nm，溶液对此波长的吸收比其它波长光线的吸收都低，其目的是使参考值有一个较低的吸收，这样可允许在相同情况下对高出参考值的血糖也能得到准确的读数。因为在这项测定中，高血糖是常见的变化方向。11．2．测定方法适用的浓度范围根据光吸收定律，溶液的吸光度应与溶液的浓度成正比。但由于有色物质的电离、水解、缔合等原因当溶液稀释或增浓时，有色物质颜色的深浅并不按比例降低或增高，因而也就不符合光吸收定律。测定方法适用的浓度范围是指分析的浓度范围在直线线性段，浓度与吸光度之比为一常数，此时直线上任何一点的斜率tanθ相等，即：tanθ＝A1/C1＝A2/C2＝A3/C3＝……＝An/Cn＝K此处K即为校正常数，可用于结果计算。通常稀溶液都是符合比耳定律的，但在浓度过高和过低时往往都不呈直线，说明低浓度部分亦有仪器的灵敏度和方法的检测能力限制，所以，具体的测定就宜选择在直线段浓度范围内进行。以此还可用于确定标本的用量，使具有临床意义的标本测定结果都落在直线范围内。11．3．观察影响颜色反应的因素影响颜色反应的主要因素有：溶液pH的影响、杂质的影响、反应的温度和时间、以及颜色的稳定性等。这些都是光度法测定误差的主要来源。都需要通过实验来观察并控制在一个适宜的范围内。从而保证方法的准确性和精密性。⒈溶液pH的影响有些溶液的颜色对pH值的改变非常灵敏。例如白蛋白在pH4左右可与溴甲酚绿结合后由黄色变成绿色，绿色的深浅与白蛋白浓度成正比，但是溴甲酚绿本身是一种pH指示剂，当pH5.4时即由黄色转变成绿色，在pH3.8时又由绿色变为黄色。在白蛋白与溴甲酚绿结合颜色反应中，如pH控制不好就很容易出现误差，又如每种酶都有各自的最适pH，酶促反应中，只有在其最适pH时才能发挥充分的催化活性。因此，在建立方法时可在不同pH值条件下（其它条件不变）令其反应，以观察颜色反应的吸光度变化，从而选择合适的pH值范围来保证颜色反应，以求较高的灵敏度和较好的线性。有时还需用相应的pH缓冲液来维持反应的pH，以利颜色反应的正常进行。⒉杂质的影响由于临床生化标本中除含待测物质外，还含有许多非测定物质，成分十分复杂，它们有的可与有色产物作用，使产生的颜色逐渐退去，有的与待测物质相类似，也能缓慢地与显色试剂生成有色化合物或沉淀，有的本身是有色的等，都会影响被测物溶液的颜色。试验方法是将各种可疑物质的纯溶液作标本单独进行测定，如产生颜色反应，这说明该方法的特异性不高。如果将待测物质混入可疑物质作标本测定，改变了被测物质与试剂间的反应，这是干扰（具体方法见第三节）。为此就需要进一步改进方法，或设立标本空白，或将标本作适当处理，除去干扰物，或加入合适的干扰物掩蔽剂等，以提高方法的特异性。⒊反应的温度和时间有些有色物质能迅速反应生成，另一些有色物质须经过相当长时间后反应才能完全。提高反应的温度可以加速化学反应，缩短反应的时间。因此，如果在不恰当的温度和时间内进行比色，将会造成相当大的误差。这可以在不同的温度下（如设定25℃，30℃，37℃）令其反应，通过检测吸光度来观察各自反应终点时间（一般达到反应终点，随后测定的吸光度不再变化），以选定适宜临床应用的反应最佳温度和时间。⒋稳定性试验待测物质经显色反应产生的有色物稳定与否，关系到测定结果的可靠性。某些有色物质虽然生成很快，但却不太稳定，放置后色泽会逐步消退或起变化，有些干扰物虽不能与被测物质同时发生颜色反应，但当放置一段时间后也能缓慢地与试剂显色，使溶液颜色加深。因此，在方法建立的同时作稳定性试验很有必要。试验的方法是用被测标本、标准溶液、空白溶液按方法要求进行显色反应后，即刻及室温放置不同时间，分别测定其吸光度，根据其吸光度的变化确定方法稳定的时间范围。一般要求有色溶液能稳定二小时以上就能满足临床应用的需要。必要时还要加以注明。12．方法建立后的临床观察方法建立的目的是为了更好地应用于临床，为疾病的诊断和治疗提供可靠的依据。因此，在方法建立后必须作临床观察试验。12．1．正常参考值试验制定参考值（referencevalues）时，首先要阅读有关资料，依照经典的文献作为研究设计的依据，使设计尽量合理，结果令人信服，有实用价值。1978年，国际临床化学委员会下属的“参考值”理论专家组发表专门文件，推荐出一套有关参考值的概念、定义、建立和使用方案。参考值的建立应包括参考个体、参考人群、参考标本、参考值、参考分布、参考限和参考区间。它们之间的关系如下：具体试验是对选定的一定人群中的健康人，按性别、年龄等分组，每组至少100人，应用所建立方法测定，如所得某体液成分的结果呈正态分析，经统计处理求出均值（X）和标准差（S），然后将X±2S定为正常参考范围。但如胆红素、铁、尿素及碱性磷酸酶等，常呈不对称的偏态分布，需经适当的数据处理，使之接近正态分布的形式，这样就可参照正态分析数据一样来对待。常用的有对数转换法，使每一个数值转换为相应的对数值，用其对数值作图，若呈正态分布，则利用此对数值计算X和S值，最后将结果转换回为相应的自然对数值，求得均值及参考值的上限和下限。确定的参考值要求符合以前的调查报告。12．2．临床病例观察试验临床病例观察的目的是指出所建方法的某项试验，对特定疾病的预示值（PV）。预示值为一项诊断试验确定或排队某疾病存在与否的诊断概率。预示值尚可分为阳性预示值（PV+）和阴性预示值（PV－）它们分别表示确定诊断或排除诊断的把握有多大，是诊断试验的评价指标。诊断试验评价指标除预示值外，还有诊断特异性、诊断灵敏度和准确度。这些指标都与疾病的发生率有关。现将有关名词的概念，作简要地介绍。⒈真阳性者（TP）经试验而被正确分类的患者的数目。⒉假阳性者（FP）经试验而被错误分类的无病试者的数目。⒊真阴性者（TN）经试验而被正确分类的无病试者的数目。⒋假阴性者（FN）经试验而被错误分类的患病试者的数目。⒌诊断灵敏度患病试者的阳性百分率。⒍诊断特异性无病试者的阴性百分率。⒎阳性结果的预示值（PV＋）阳性结果中真阳性者的百分数。⒏阴性结果的预示值（PV－）阴性结果中真阴性者的百分数。⒐实验的总有效率所有实验结果中正确结果的百分数。在临床应用中，主要以阳性结果的预示值观察实验结果的使用价值。但在固定参考范围的条件下，对不同发病率的人群进行相同指标检测时，所得到的预示值会有很大变化。例如用某方法对某专科病房检测100个标本，发病率为50％，方法诊断灵敏度为95％，诊断特异性为95％。由此数据可知：TP＝50×95％＝47.5人；FN＝50－47.5＝2.5人；TN＝50×95％＝47.5人；FP＝50－47.5＝2.5人；TP＋FP＝50人，TN＋FN＝50人临床对该检测方法的运用满意。经同样方法用于普查，调查某地区发病率为5％，检测1000例中，950人为非病人，50人为病人。TP＝50×95％＝47.5人；FN＝50－47.5＝2.5人；TN＝950×95％＝902.5人；FP＝950－902.5＝47.5人；PV＋＝47.5/95×100％＝50％PV－＝902.5/905×100％＝99.7％总有效率＝(47.5+902.5)/(95+905)×100％＝95％临床认为这个检验方法使用价值不高，因为在普查中假阳性率占50％，给进一步诊断带来困难。如可能可调整参数值范围来提高方法的使用价值。一般认为，用于过筛实验的分析方法，希望有最高的灵敏度；用于确诊实验的分析方法，必须有高特异性。四．相关文件《检验程序的质量保证》检验科仪器设备采购控制程序1目的。