[精编]血吸虫病肝纤维化治疗论文.doc

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血吸虫病肝纤维化治疗论文【摘要目的摘要：探索维生素E(VitE)抗小鼠日本血吸虫病肝纤维化功能及其机制.方法摘要：用日本血吸虫尾蚴皮肤敷贴法感染小鼠，构建日本血吸虫病肝纤维化模型，以肝纤维化达Ⅱ级或Ⅱ级以上作为开始VitE治疗标志.实验分5组摘要：正常对照组、模型组及VitE高、中、低剂量组(每日150,50,5mg/kg),8wk末处死动物，HE和VG染色对肝组织进行病理学检查，分光光度法检测肝组织丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性，免疫组化SP法检测肝星状细胞(HSC)标记物α平滑肌动蛋白(αSMA)表达，RTPCR方法检测肝脏α1(I)型前胶原mRNA表达.结果摘要：VitE降低模型组肝脏MDA含量［(5.00±0.31)μmol/gvs(11.66±1.84)μmol/g,P%26lt;0.05］，提高SOD活性［(249.84±26.22)μkat/gvs(120.11±42.61)μkat/g,P%26lt;0.05］；减少αSMA阳性表达［(0.41±0.02)vs(0.68±0.02),P%26lt;0.05］；降低肝脏胶原含量［(0.23±0.01)vs(0.60±0.11),P%26lt;0.05］和α1(I)型前胶原基因表达［(0.28±0.01)vs(0.85±0.15),P%26lt;0.05］.结论摘要：VitE具有抗小鼠日本血吸虫病肝纤维化功能，其机制和抗脂质过氧化功能、抑制HSC活化和增殖、降低α1(I)型前胶原基因表达和胶原合成有关.【血吸虫病，日本；肝硬化；维生素E；氧化性应激；肝星状细胞；胶原I型日本血吸虫病是我国危害最大的寄生虫病之一，而肝纤维化是日本血吸虫病致死和形成严重并发症最重要的原因.探究表明，在血吸虫病肝纤维化形成过程中，氧化应激发挥重要功能，参和血吸虫对宿主的损伤，自由基可能是血吸虫病主要的致病因素［1］.VitE作为机体防御氧化应激损伤的重要抗氧化剂，已应用于治疗肝纤维化，但有关VitE抗日本血吸虫病肝纤维化功能的探究国内外报道甚少，而VitE治疗血吸虫病肝纤维化的功能机制尚未见文献报道.我们观察VitE抗日本血吸虫病肝纤维化功能，探索其机制如下.1材料和方法1.1材料健康雄性昆明小鼠(18～22)g及日本血吸虫尾蚴阳性钉螺(湖北省血吸虫病防治探究所)，皮肤敷贴法感染日本血吸虫尾蚴（20±1）条/只，于感染后8,10,12wk末分别处死6只小鼠后取肝组织进行病理学检查，以肝纤维化达Ⅱ级或Ⅱ级以上作为VitE开始治疗的标志，即在12wk末开始给予VitE治疗.32只感染小鼠分为4组，每组8只摘要：1组，模型组；2组，VitE高剂量组(VitE每日150mg/kg)；3组，中剂量组(50mg/kg)；4组，低剂量组(5mg/kg).VitE胶丸由厦门鱼肝油厂生产，剪破胶丸，用蒸馏水配制所需浓度的混悬液，灌胃给药每日1次，连续8wk.另取同一批健康小鼠10只作为正常对照组.丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒(南京建成生物工程探究所)，免疫组化所用试剂(北京博奥申生物技术有限公司)，TRIzol(美国Invitrogen)，逆转录试剂盒(美国Promega)，Taq酶(Gibco公司).α1(I)型前胶原引物序列参照GenBank，上游序列摘要:5′GAGCGGAGAGTACTGGATCG3′，下游序列摘要:5′TGCTGTAGGTGAAGCGACTG3′，扩增片段为419bp；内参照βactin引物上游序列摘要:5′TGTCACCAACTGGGACGATA3′，下游序列摘要:5′AGGTCTTTACGGATGTCAACG3′，扩增片段为654bp，引物由北京奥科生物技术有限公司合成.1.2方法断颈处死小鼠，取肝右叶相同部位肝组织2块，1块于-70℃保存，测定肝组织匀浆MDA含量、SOD活性及肝脏α1(I)型前胶原基因表达；1块固定于100mL/L中性甲醛，石蜡包埋，行HE和VG及αSMA免疫组化染色.1.2.1肝组织病理学及纤维化评分常规行HE和VG染色，光镜下观察肝小叶病理变化及肝纤维化程度分级摘要：0级20=1，正常；Ⅰ级21=2，胶原纤维包绕虫卵肉芽肿四周；Ⅱ级22=4，汇管区有大量纤维，小叶间仅有少量纤维；Ⅲ级23=8，纤维组织大量延伸至肝小叶间.应用HPIAS1000高清楚度彩色病理图文分析系统，每组每次测量20～30个由单个成熟虫卵形成的肉芽肿两个直角相交直径，以(最大横径+最大纵径)/2为平均值，并计算各组均值；测定VG染色切片胶原纤维灰度面积(S)和视野总面积(T)，用S/T比值表示胶原含量.1.2.2肝组织匀浆MDA含量和SOD活性测定硫代巴比妥酸比色法测定肝脏MDA含量，黄嘌呤氧化法测定SOD活性，按试剂盒说明书要求操作.1.2.3肝脏αSMA免疫组化采用SP法，兔抗鼠αSMA抗体稀释度1∶100，用已知阳性片做阳性对照，PBS液代替一抗做阴性对照，细胞内出现棕黄色颗粒为阳性细胞.应用HPIAS1000高清楚度彩色病理图文分析系统对αSMA免疫组化切片进行平均吸光度值检测.1.2.4肝脏α1(I)型前胶原基因表达应用TRIzol试剂盒，参照说明提取肝组织总RNA，逆转录合成cDNA，采用20μL反应体系.PCR反应条件摘要：95℃变性5min,94℃30s,94℃30s,52.7℃退火30s,72℃延伸30s，循环30次，最后72℃终止10min，以βactin为内参照.PCR产物分析摘要：PCR产物经2kg/L琼脂糖凝胶2μL电泳检测，结果照相并存入凝胶分析系统，以βactin光密度值标化α1(I)型前型胶原基因光密度值，得到α1(I)型前胶原基因相对含量.统计学处理摘要：采用SPSS12.0统计软件对结果进行统计学分析，数据均采用x±s表示，采用方差分析进行比较，P%26lt;0.05为差异有统计学意义.多组均数间的多重比较采用LSD法.2结果2.1肝脏病理学变化对照组无明显组织学异常.1组摘要：HE和VG染色示小鼠血吸虫病肝纤维化模型建立成功.血吸虫感染后8wk，虫卵肉芽肿大小和数量达到高峰，大量炎性细胞浸润；随感染时间延长，肉芽肿逐渐缩小，肝细胞变性、坏死和炎性细胞浸润明显减轻，胶原纤维逐渐增多.至20wk，胶原纤维由最初的细线状变为条索状或网状分布在汇管区、虫卵肉芽肿四周并延伸至肝小叶间(图1A，B).VitE组肉芽肿大小和1组比较无显著差异(P%26gt;0.05)，对肝细胞变性、坏死和炎性细胞浸润程度影响不明显；2，3组虽有不同程度肝纤维化，但纤维带变细、窄、短，胶原纤维局限于汇管区和肉芽肿内及四周，肝小叶间很少有胶原沉积(图1C)，和1组比较，肝纤维化程度分级差异有显著性(P%26lt;0.05).4组和1组比较无明显差异(表1).2.2肝脏MDA含量和SOD活性和对照组比较，1组SOD活性下降(P%26lt;0.05)，MDA含量增多(P%26lt;0.05)，有统计学意义.2,3组SOD活性和1组比较升高(P%26lt;0.05)，但和对照组比较仍相差甚远(P%26lt;0.05)；2,3组MDA含量和1组比较减少(P%26lt;0.05)，2组和对照组比较无显著性差异(P%26gt;0.05)；4组和1组比较无明显差异(表1).A摘要:模型组×100;B摘要:模型组×200;C摘要:VitE组×100.图1肝脏胶原纤维分布VG 2.3肝脏αSMA表达对照组肝脏血管壁、胆管壁平滑肌有少许αSMA阳性表达，汇管区及肝窦内基本无αSMA阳性表达；1组汇管区、虫卵肉芽肿内及四周胶原纤维沉积处可见大量索状αSMA阳性表达细胞，肝窦内可见多量αSMA阳性表达细胞(图2A,B)；2,3组αSMA阳性细胞数目减少(P%26lt;0.05)，局限在汇管区、纤细的纤维隔及肉芽肿内及四周，肝窦内表达减少(图2C)；4组和1组比较无明显差异(表1).A摘要:模型组×100;B摘要:模型组×200;C摘要:VitE组×100.表1VitE对虫卵肉芽肿直径、MAD含量、SOD活性、αSMA平均吸光度值及肝纤维程度的影响2.4肝脏α1(I)型前胶原基因表达和胶原含量1组(即感染20wk末)α1(I)型前胶原mRNA和胶原含量高于感染12wk时(P%26lt;0.05和P%26lt;0.05)和对照组(P%26lt;0.05和P%26lt;0.05).2,3组α1(I)型前胶原mRNA和胶原含量和1组比较差异有显著性(P%26lt;0.05和P%26lt;0.05)；2组α1(I)型前胶原mRNA和胶原含量和感染12wk时比较有显著性差异(P%26lt;0.05和P%26lt;0.05)，而3组无统计学意义(P%26gt;0.05)；4组和1组比较无明显差异(图3，表2).M摘要:marker;1摘要:模型组;2摘要:感染12wk;3摘要:VitE高剂量组;4摘要:VitE中剂量组;5摘要:VitE低剂量组.图3RTPCR分析各组α1(I)型前胶原mRNA表达表2VitE对胶原含量和α1(I)型前胶原基因表达的影响3讨论氧化应激是多种病因所致肝纤维化发生发展的重要环节之一［2］.VitE作为体内一个重要的抗氧化剂，有抗肝纤维化［3-5］、抗肿瘤、抗衰老等功能.宗道明等［5］探究表明，VitE可降低血吸虫病肝纤维化患者血清肝纤维化各项指标，对肝纤维化组织形态学的好转有积极功能，治疗血吸虫病肝纤维化疗效显著.但目前有关VitE抗血吸虫病肝纤维化机制少见文献报道.Chojkier等［6］探究表明，VitE抑制HSCα1(I)型胶原基因表达.我们发现，VitE降低肝脏α1(I)型前胶原基因表达、胶原含量及肝纤维化程度分级；2组α1(I)型前胶原mRNA和胶原含量显著低于感染12wk时.可见VitE可延缓血吸虫病肝纤维化进程，减轻肝纤维化程度.本探究中，1组MDA含量增加，SOD活性下降，说明日本血吸虫病肝纤维化之肝脏发生氧化应激反应，产生脂质过氧化损伤，和文献［1］报道一致，而VitE能够不同程度地逆转这些改变，对此具有一定的治疗功能；并且VitE抑制HSC活化和增殖.VitE可能通过抑制肝脏脂质过氧化功能和由此产生的活性醛，如MDA和4羟化壬烯(4HNE)，从而抑制MDA和4HNE蛋白加合物形成，该加合物是实验性肝损伤和肝纤维化联系的枢纽［7］，进而抑制氧化应激诱导的HSCα1(I)型前型胶原基因表达和蛋白合成［8］.我们发现VitE尚不能完全逆转SOD活性，故对其剂量、疗程以及和其它药物的联合应用有待于进一步的探究.总之，VitE可延缓血吸虫病肝纤维化进程，减轻肝纤维化程度，其机制和抗脂质过氧化功能、抑制HSC活化和增殖、降低α1(I)型前胶原基因表达和胶原合成有关，适当补充VitE进行抗纤维化治疗是一种可行的手段，有望成为一种廉价、不良反应少、疗效显著的临床用药.【参考文献［1］ElSokkaryGH,OmarHM,HassaneinAFMM,etal.MelatoninreducesoxidativedamageandincreasessurvivalofmiceinfectedwithSchistosomamansoni［J］.FreeRadicBiolMed,2002,32(4)摘要:319-332.［2］ParolaM,RobinoG.Oxidativestressrelatedmoleculesandliverfibrosis［J］.JHeptol,2001,35(2)摘要:297-306.［3］HouglumK,VenkataramaniA,LycheK,etal.ApilotstudyoftheeffectsofdalphatocopherolonhepaticstellatecellactivationinchronichepatitisC［J］.Gastroenterology,1997,113(4)摘要:1069-1073.［4］孙军，丁虹，沈志祥.维生素E对小鼠慢性乙醇性肝损害的保护功能［J］.胃肠病学和肝病学杂志，2001,10(1)摘要:47-49.［5］宗道明，冯韵琴，赵晓贡.维生素E治疗血吸虫病肝纤维化的临床探究［J］.中国寄生虫防治杂志,2005,18(3)摘要:212-213.［6］ChojkierM,HouglumK,LeeKS,etal.LongandshorttermDαtocopherolsupplementationinhibitslivercollagenα1(Ⅰ)geneexpression［J］.AmJPhysiolGastrointestLiverPhysiol,1998,275(6)摘要:G1480G1485.［7］BedossaP,HouglumK,TrautweinC,etal.Stimulationofcollagenα1(Ⅰ)geneexpressionisassociatedwithlipidperoxidationinhepatocellularinjury摘要:Alinktotissuefibrosis?［J］.Hepatology,1994,19(5)摘要:1262-1271.［8］CasiniA,CeniE,SalzanoR,etal.NeutrophilderivedsuperoxideanioninduceslipidperoxidationandstimulatecollagensynthesisinhumanhepaticStellatecells摘要:Roleofnitricoxide［J］.Hepatology,1997,25(2)摘要:361-367 1、最灵梦想是一个天真的词，实现梦想是个残酷的词。。。21.2.12.1.202122:2422:24:17Feb-2122:24 2、只有收获，才能检验耕耘的好处；只有贡献，方可衡量人生的价值。。二〇二一年二月一日2021年2月1日星期一3、不要放弃，你要配的上自己的野心，也不要辜负了所受的苦难。。22:242.1.202122:242.1.202122:2422:24:172.1.202122:242.1.2021 4、找一个理由，否认忧伤，笑容就会灿烂到无所不在。。2.1.20212.1.202122:2422:2422:24:1722:24:17 5、成功与不成功之间有时距离很短——只要后者再向前几步。。February 21Monday,February 1,20212/1/2021 6、只要努力抬起你的双脚，胜利将属于你。。10时24分10时24分1-Feb-212.1.2021 7、青春如此华美，却在烟火在散场。。21.2.121.2.121.2.1。2021年2月1日星期一二〇二一年二月一日8、真正没有资格谈明天的人，是那个不懂得珍惜今日的人。。22:2422:24:172.1.2021Monday,February 1,2021 1、你始终不属于我，属于我的只是我自己。。21.2.12.1.202122:2422:24:17Feb-2122:24 2、一份信心，一份努力，一份成功；十分信心，十分努力，十分成功。。二〇二一年二月一日2021年2月1日星期一3、你是唯一的，你是十分独特的，你就是你生命中的第一名。。22:242.1.202122:242.1.202122:2422:24:172.1.202122:242.1.2021 4、要跟成功者有同样的结果，就必须采取同样的行动。。2.1.20212.1.202122:2422:2422:24:1722:24:17 5、我们的生命，就是以不断出发的姿势得到重生。。February 21Monday,February 1,20212/1/2021 6、只要站起来的次数比倒下去的次数多，那就是成功。10时24分10时24分1-Feb-212.1.2021 7、自知之明是最难得的知识。21.2.121.2.121.2.1。2021年2月1日星期一二〇二一年二月一日8、勇气通往天堂，怯懦通往地狱。22:2422:24:172.1.2021Monday,February 1,2021 1、最灵繁的人也看不见自己的背脊。21.2.12.1.202122:2422:24:17Feb-2122:24 2、最困难的事情就是认识自己。二〇二一年二月一日2021年2月1日星期一3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。22:242.1.202122:242.1.202122:2422:24:172.1.202122:242.1.2021 4、与肝胆人共事，无字句处读书。2.1.20212.1.202122:2422:2422:24:1722:24:17 5、阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使人精确。February 21Monday,February 1,20212/1/2021 6、最大的骄傲于最大的自卑都表示心灵的最软弱无力。10时24分10时24分1-Feb-212.1.2021 7、自知之明是最难得的知识。21.2.121.2.121.2.1。2021年2月1日星期一二〇二一年二月一日8、勇气通往天堂，怯懦通往地狱。22:2422:24:172.1.2021Monday,February 1,2021。