分子克隆实验报告7页.doc

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分子克隆实验报告实验名称：分子克隆、分子杂交、基因表达检测实验类型：综合性指导教师：李一博班级：A姓名：孙阳阳学号：2014304110100实验时间：2015/8/19—2015/8/25实验一分子克隆DNA重组技术包括载体及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的获得及纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。DNA片段的克隆技术是分子操作的核心部分实验原理及方法DNA提取：（CTAB法）CTAB是一种非离子去污剂，植物材料在CTAB的处理下，结合65°C水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70－75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。再经过氯仿/异戊醇(24:1)抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离出来。感受态细胞的制备及质粒的转化质粒提取：在pH 12.0~12.6碱性环境中，细菌大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA CaCl2法：利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。106～107转化子/mg DNA。酶切酶连：限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平末端的外源片段，经纯化处理后的DNA用于连接反应；选择克隆载体pUC19多克隆位点上相应的限制性内切酶切割，并用碱性磷酸酶处理防止载体自连；在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。实验材料和试剂携带pUC19质粒载体的大肠杆菌菌液；携带含有水稻DNA片段的M812载体的大肠杆菌菌液；氨苄青霉素、卡那霉素；RNaseA；碱裂解法试剂Solution I:Tris.HCl（pH 7.5）50 mM EDTA 10 mM RNase A 100µg/ml Solution II:NaOH 0.2 M SDS 1%Solution III:KAC 1.32 M Using HAC to adjust pH to 4.8 TE(pH 8.0)：Tris.HCl（pH 8.0）10 mM EDTA（pH 8.0）1 mM苯酚/氯仿、无水乙醇或异丙醇主要实验步骤1.两种载体的抽提2.琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA的质量3.两种载体的限制性内切酶消化4.目的片段的回收及亚克隆载体的去磷酸化5.载体与外源DNA的连接6.感受态细胞的制备7.连接子转化感受态细胞8.重组子筛选及鉴定实验结果与分析1.质粒的质量检测，-20℃保存。菌种PUC19M812个人编号56785678浓度ng/ul248.5325.6244.6297.6609.6603.3592.2689.7A260/2801.881.861.811.891.861.831.861.80电泳结果，只检测条带不有点marker M5、M6条带较亮有拖带，可能点样偏多A260/280质较好，提取效果比较好M5 P5 M6 P6 2.琼脂糖凝胶电泳点样顺序1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 pUC19质粒酶切产物(1—4)pUC19质粒对照（5）Marker（6）M812质粒对照（7）M812质粒酶切产物（8—11）3.涂皿生长结果5,6,7,8蓝白斑不明显，肉眼可见蓝色小斑点。阳性对照蓝色斑点很多也长了白斑。产生这种结果的原因可能无菌操作有问题，感受态制备不好。PUC19酶切后ME PUC19实验二、分子杂交对于大的基因组，DNA酶切图谱凭肉眼是分辨不开的（EB染色），因为大小不等的分子呈现弥散分布，只有借助灵敏的放射性同位素（或其他发光物质），将靶DNA在凝胶上（膜上）的带型通过特定的探针与之杂交，转换成X光片上直观的带型，才能进行相关分析。另外如果需要鉴定或寻找与已知DNA同源的DNA片段如：染色体步查、基因组文库的评价和利用、阳性克隆的分析鉴定、转基因拷贝数分析等也都需进行DNA的分子杂交实验。杂交探针的标记可以采用同位素或地高辛标记，两种标记探针的分子杂交、洗膜过程和信号检测方法不同。实验目的：水稻转基因植株的阳性鉴定及拷贝数检测实验原理：带正电荷的尼龙膜强度高，不易破损，具有较大的DNA结合容量，它能够吸附变性DNA，核酸以共价结合方式不可逆的结合在尼龙膜上。尼龙膜两边均有同样吸附DNA功能，经向上的毛细吸附作用，在转移缓冲液的带动下把DNA从凝胶上转到膜上。DNA转到膜上是复制胶上的带型，在80-100℃真空干燥2-4 hrs，即可固定DNA。转膜方法一般有两种，即盐转移和碱转移，本实验选用盐转移的方法。实验过程1.植物总DNA的抽提2.植物总DNA质量检测3.DNA的琼脂糖凝胶电泳4.限制性内切酶操作5.Southern Blotting 6.探针的地高辛标记、杂交、免疫反应及显色A5 A6 A7 A8实验结果与分析植物总DNA浓度检测结果编号5678浓度ng/ul1979.81374968.11436.8A260/2802.012.132.142.18DNA酶切A260/A280值偏高，可能提取过程中RNA未除尽。酶切效果检测琼脂糖凝胶电泳结见DNA酶切图，照胶不太清晰，A5-A8酶切条带有，能够看到切开，剩余产物可电泳做分子杂交Marker+—5 6 7 8分子杂交结果照像只有marker和阳性对照结果出现其他均无杂交条带，可能DNA酶切质量不好，或者电泳胶上边切多了，杂交条带在上面未转到膜上。杂交显影实验三、基因表达检测在转录水平上研究和了解基因的表达与调控是分子生物学和基因操作的重要内容。Northern杂交可以测定总RNA或poly(A)+RNA中特定mRNA分子的大小和表达丰度，RNA分子在变性琼脂糖凝胶中电泳，按其分子的大小分开，然后将RNA转至尼龙膜或硝酸纤维素膜上，经过体外铰链固定，用放射性同位素标记的DNA或RNA探针与之杂交，放射自显影后即可以得到待测基因RNA表达水平的情况；RT-PCR以mRNA反转录生成的cDNA作为PCR的模板进行扩增，比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。实验原理：mRNA反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增称为RT-PCR；RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。实验目的：检测基因的表达水平实验过程1.植物总RNA的抽提（trizol）2.RNA电泳3.mRNA的反转录4.PCR技术5.RT-PCR 5 6 7 8实验结果与分析RNA质量检测：电泳没有明显的两条带，28S和18S没有区分，有拖带。RNA检测出现此结果的原因，RNA提取过程中有降解，电泳过程中RNA降解RT-PCR电泳结果+—5 6 7 8 RT-PCR有明显的条带，marker不太好亮度不够，也表明RNA反转录不错。