抗磷脂抗体所针对的抗原β2gp1的分子克隆表达及临床应用.doc

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抗磷脂抗体所针对的抗原P 2GP1的分子克隆表达及临床应用抗磷脂抗体所针对的抗原P2GP1的分子克隆表达及临床应用2009-10-17杨程德陈顺乐沈南顾越英鲍春德摘要目的：用分子生物学的方法克隆表达抗磷脂抗体所针对的抗原B2GP1,并研究抗B2GP1抗体的临床意义。方法：用RT-PCR的方.法从肝细胞中克隆出P2GP1CDNA,并构建重组载体，用纯化的重组P2GP1为抗原建立抗P2GP1的ELTSA方法。结果：IgG类抗B 2GP1与IgG类抗心磷脂抗体的检测结果间呈正相关关系(r=0.667),抗P2GP1抗体阳性组患者与阴性组患者的血栓等临床症状的发生率有显著性差异(P=0.002 408)o结论：抗B2GP1抗体的检测对自身免疫性疾病患者的血栓等症状有预测价值，其特异性比常规抗心磷脂抗体的方法为高。关键词抗磷脂抗体综合征抗磷脂抗体抗原CLONING AND EXPRESSION OF B 2GP1 RECOGNIZED BY ANTIPHOSPHOLIPID ANTIBODIES,AND ITS CLINICAL INVESTIGATION Yang Chengde,Chen Shun 1 e,Shen Nan,Gu Yueying,Bao Chunde.Ren ji Hospital,Shanghai Second Medical University,Shanghai,200001.Abstract Objective:To study cloning and expression of 8 2GP1 whi ch recognized by anti phosphol i pi d anti bodi es,and the cl inical signifi cance of anti-P 2GP1 antibodies in patients.Methods:By using reverse transcription-PCR method,the human P 2GP1 cDNA from liver cel Is was obtained and its expression vector was constructed.Using recombinant 8 2GP1 as anti gen,anti-P 2GP1 ELTSA method was established.Results:The values of TgG anti-P 2GP1 and TgG aCL ELTSA assay showed a signifleant correlation(r=0.667).The presence of anti-P 2GP1 antibodies was associated with an increased frequency of history of thrombosis(P=0.002 408).Conclusion:Detection of anti-3 2GP1 antibodies in patients is of potential value for predicting the thrombosis and other APS-associated symptoms.Key words antiphospholipid syndrome antiphospholipid antibody antigen抗磷脂抗体综合征(antiphospholipid syndrome,APS)的主要临床表现为反复的动脉、静脉血栓、多发性流产、血小板减少症等症状。临床上可分为原发性及继发性APS,后者可继发于多种自身免疫性疾病。APS患者血清中存在中高滴度的抗磷脂抗体(antiphospholipid antibodies,aPL),临床上常用检测aPL的方法有狼疮抗凝因子及抗心磷脂抗体(anticardiolipin antibodies,aCL)的检测〔1)。1990年McNeil〔2)发现用离子交换及磷脂亲和纯化的aCL不能在无小牛血清的ELISA反应系统中与反应板上的心磷脂结合，当反应系统恢复血清成分后，aCL也恢复了与心磷脂结合的活性，成分分析表明起这种作用的是血浆中的磷脂结合蛋白-B2GP1(B2 glycoprotein 1),以后有些实验揭示aCL所直接针对的抗原可能不是磷脂而是与心磷脂结合的B2GP1。为了研究抗B2GP1抗体的临床意义，本研究构建了重组质粒，用重组P 2GP1建立了抗P 2GP1抗体检测方法并初步探讨其临床意义。1材料和方法1.1 PCR引物设计：根据Steinkasserer等⑶报道的8 2GP1 cDNA全长序列，设计了克隆全长的引物，设计的两对引物分别位于3 2GP1 cDNA的16-39及1 040-1 062位碱基，并在引物5’端分别添加BamHI及EcoRI的内切酶位点序列，引物由中国科学院细胞研究所合成。1.2 B 2GP1 cDNA的逆转录合成、重组质粒的构建：取新鲜胎肝10 mg抽取总RNA。逆转录反应及重组质粒的构建见文献〔4）。1.3重组质粒转化：参照氯化镁法（4）稍加改进。1.4高效表达克隆筛选：挑取带有插入目的基因的克隆分别进行培养，当A值0.6左右时加入诱导剂IPTG,使终浓度为0.1 mmol/L,分别于0小时、1小时、2小时、3小时、4小时取样,SDS-PAGE电泳检测重组蛋白表达。1.5测序：抽提高效表达克隆质粒，切下cDNA插入子，与测序质粒Blue SKII连接，用ABI373A自动测序仪进行标记终止子法测序。1.6重组蛋白的纯化：用谷胱甘肽-Sepharose 4 B亲和层析柱（Promega）纯化，具体方法按操作说明。1.7研究对象：血清标本获自本院门诊及住院病人。共选择了112例病例供研究，其中系统性红斑狼疮（SLE）84例（有8例符合继发性抗磷脂抗体综合征的诊断），原发性抗磷脂抗体综合征3例，多发性流产7例（aCL阳性），其它结缔组织疾病18例。SLE等疾病的诊断符合美国风湿病学会制订的1982年系统性红斑狼疮分类的修订标准及其它分类标准（5,6）。血栓的诊断依据相关的临床表现及血管造影、CT、MRI等相关检查。1.8抗心磷脂抗体测定：具体方法见文献〔7）。1.9抗B2GP1抗体测定（8）：96孔酶标反应板经60Co处理，使其表面氧化（剂量为10 kGy,第二军医大学辐照中心），重组P2GP1的包被浓度为2mg/L（包被夜为pH 9.6碳酸氢盐缓冲液），100 u 1/孔包被反应板，4°C过夜，pH 7.4,PBS-Tween 20洗板，5分钟/次X3,用含5%的牛血清白蛋白-0.3%明胶液封闭37°C 2小时，pH 7.4 PBS-Tween 20洗板，5分钟/次X 3,加入1：100稀释的待检血清（用含1%牛血清白蛋白-0.3%明胶稀释），37°C 1小时后，pH 7.4,PBS-Tween 20洗板，5分钟/次X3,分别加入稀释的酶标抗体HRP-羊抗人IgG 37°C 1小时后,pH 7.4 PBS-Tween 20洗板,5分钟/次X3,加入底物TMB显色，450 mn测A值。结果判定：当样品的A值/阴性对照平均A值（P/N）N2.1时为阳性。2结果2.1 B2GP1 cDNA PCR扩增结果：电泳结果在1 000 bp~l 100 bp间可见一清晰条带，与目的基因1 062 bp相符。2.2测序：核昔酸的测序结果与文献报道的一致。2.3 B 2GP1重组质粒诱导表达的结果：空白PGEX-2T质粒经诱导后,在26 kD处有谷胱甘肽筑基转移酶(GST)的浓集蛋白条带，重组B 2GP1质粒经诱导可见在64 kD处有一浓集的蛋白条带，与目的蛋白的大小一致。2.4 IgG类抗3 2GP1抗体与aCL检测结果的关系：为了研究抗3 2GP1抗体与aCL之间的关系，每一份样本均作抗B 2GP1抗体及aCL的检测，IgG类抗B 2GP1与IgG类aCL的检测结果见图1。两种方法的IgG类抗B 2GP1与IgG类aCL的检测结果呈正相关关系(r=0.667),如按常规aCL ELISA法检测的结果，可把患者血清分为四组:阴性(W3 s)、低度阳性(3 s~5 s)、中度阳性(5 s~10 s)、高度阳性(10 s以上),IgG抗B2GP1的阳性率(%)分别为1.6%(1/61)、22.2%(4/18)68.2%(15/22)72.2%(8/ll)o。